楊謹(jǐn)如，秦露露，朱勇飛*

(湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，湖南長沙 410013)

慢性髓系白血病(chronic myelognous leukemia，CML)是一種影響血液及骨髓的惡性腫瘤，它的特點是產(chǎn)生大量不成熟的白細(xì)胞，這些白細(xì)胞在骨髓內(nèi)聚集，抑制骨髓的正常造血，導(dǎo)致病人出現(xiàn)貧血、容易出血、感染及器官浸潤等。95%的病例來源于費城染色體(Ph)——9號和22號染色體相互易位形成，從而使位于染色體9q34的c-ABL基因3′端與位于染色體22q11的斷裂點簇集區(qū)(breakpoint cluster region，BCR)基因的5′端融合，形成BCR-ABL融合基因，該基因編碼產(chǎn)生的BCR-ABL融合蛋白具有組成性的酪氨酸激酶活性，通過激活下游一系列信號傳導(dǎo)途徑導(dǎo)致CML的發(fā)生[1]。我國CML的年發(fā)病率為36/10萬[2]，總生存率較低，疾病負(fù)擔(dān)較重[3]。雖然Ph突變是典型的病理性驅(qū)動突變，但我們也希望通過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)新的分子標(biāo)志和靶點，為臨床治療CML提供更好的方法和藥物。研究表明，伊馬替尼治療失敗的CML中，酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生了各種點突變[4]，其中許多有利于激酶活性的構(gòu)象[1]。

JAK2定位于染色體9p24，屬于JAKs(Janus kinases/Just another kinases)家族，其在細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)中起重要作用[5]。JAK2突變體可以增強酪氨酸激酶的活性，研究顯示該突變體對轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生了致病作用[6]。JAK2突變產(chǎn)物包括JAKV617F和JAK2exon12[7]。JAKV617F是由第14號外顯子編碼序列的第1 849位堿基G被T取代，導(dǎo)致JH2假激酶區(qū)617位置纈氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸奖彼幔蛔兌嘁娪谡嫘约t細(xì)胞增多癥。JAK2外顯子12與JAKV617F的突變機制相似。本文以近15年國內(nèi)外開展的JAK2突變與CML疾病情況的研究進(jìn)行meta分析，以期為CML的發(fā)病機制及遺傳學(xué)研究提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 檢索策略

計 算機 檢 索 CNKI、 PubMed、 Web of Science、VIP、CBM、Wanfang數(shù)據(jù)庫，檢索論文時限為2003年9月—2018年9月，同時追溯納入研究的參考文獻(xiàn)，查找研究JAK2突變與CML的文獻(xiàn)。中文檢索詞包括：慢性髓系白血病、CML、JAK2；英文檢索詞包括：chronic myelognous leukemia、CML、JAK2。以CNKI和PubMed為例，其具體的檢索策略見表1。

表1 檢索策略

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

研究類型：隨機對照試驗(計數(shù)資料)；研究對象：慢性髓系白血病患者；結(jié)局指標(biāo)：可檢測到研究對象是否發(fā)生了JAK2突變。

文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)：①已發(fā)表的中文或英文文獻(xiàn)；②研究對象為臨床明確診斷的CML患者，年齡、性別、種族和教育程度不限；③各文獻(xiàn)基因突變檢測方法相似；④文獻(xiàn)必須提供CML患者中JAK2突變個體數(shù)量的信息，能直接或間接提供統(tǒng)計指標(biāo)計算基因突變率；⑤納入文獻(xiàn)均符合研究目的。排除標(biāo)準(zhǔn)：①重復(fù)發(fā)表文獻(xiàn)；②綜述類型文獻(xiàn)；③各種原因無法獲得全文及不能滿足Cochrane手冊要求的文獻(xiàn)；④資料不全，無法獲得相關(guān)數(shù)據(jù)的文獻(xiàn)。

1.3 文獻(xiàn)篩選、資料提取與質(zhì)量評價

在文獻(xiàn)篩選的過程中，發(fā)現(xiàn)和本研究目的有關(guān)的文獻(xiàn)均為JAK2突變與患CML的研究論文。由兩位研究者獨立按照納入與排除標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行文獻(xiàn)的篩選，提取資料并進(jìn)行交叉核對，如遇分歧，則由第三位研究者協(xié)助判斷，如果發(fā)現(xiàn)資料缺失則盡量聯(lián)系作者獲取文獻(xiàn)資料再予以補充。文獻(xiàn)篩選首先應(yīng)閱讀文題及摘要，若符合納入標(biāo)準(zhǔn)則進(jìn)一步閱讀全文，判斷是否最終納入。資料的提取包括第一作者、發(fā)表時間、研究設(shè)計類型、質(zhì)量評價的關(guān)鍵要素、研究者基因突變情況、結(jié)局指標(biāo)、研究質(zhì)量、研究結(jié)果。

本次研究中文獻(xiàn)質(zhì)量評估體系采用紐卡斯?fàn)枺滋A量表(The Newcastle-Ottawa Scale，NOS)[8]進(jìn)行評價。量表總分共9分，質(zhì)量可分為3個等級，6分以上屬于高質(zhì)量文獻(xiàn)。

1.4 統(tǒng)計分析

對符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)歸納整理后采用Stata 11.0、RevMan 5.3進(jìn)行定量分析。對納入的研究進(jìn)行異質(zhì)性檢驗以選取符合的模型進(jìn)行分析，用I2表示異質(zhì)性的大小，I2值越大則異質(zhì)性越大，異質(zhì)性的檢驗水準(zhǔn)為0.10，若I2≤0.1則表明納入的文獻(xiàn)異質(zhì)性較大，需要采用隨機效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析，若I2>0.1則表明納入的文獻(xiàn)異質(zhì)性較小或無異質(zhì)性，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并分析。合并的效應(yīng)量用合并的突變率和95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)表示。用Z檢驗來評估合并效應(yīng)值的顯著性，檢驗水準(zhǔn)為0.05，當(dāng)假設(shè)檢驗的P<0.05，則證明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義并可結(jié)合可信區(qū)間進(jìn)行分析。為了探索研究中異質(zhì)性的來源，對所納入的研究進(jìn)行亞組分析，按照Ph+/JAK2+或 Ph+/JAK2-或 Ph-/JAK2+或 Ph-/JAK2-、不同地區(qū)分布情況、不同外顯子突變位點進(jìn)行分組，進(jìn)一步分析。另外對合并的研究結(jié)果進(jìn)行敏感性分析，并通過繪制漏斗圖及Egger線性回歸評價所納入研究的發(fā)表偏倚。本研究中meta分析的檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果

根據(jù)PRISMA[9]繪制的文獻(xiàn)篩選流程和結(jié)果見圖1?？梢姵鯔z出379篇文獻(xiàn)，閱讀文題及摘要后排除211篇文獻(xiàn)，剩余168篇文獻(xiàn)進(jìn)一步閱讀全文，排除重復(fù)發(fā)表文獻(xiàn)49篇，綜述類文獻(xiàn)68篇，以及研究質(zhì)量不符合要求的文獻(xiàn)30篇，實驗中無相關(guān)數(shù)據(jù)的文獻(xiàn)6篇，最終納入15項研究。

圖1 文獻(xiàn)篩選及結(jié)果

2.2 納入研究的基本特征與方法學(xué)評價

本研究納入Meta分析文獻(xiàn)共15篇。研究對象均為CML患者，總病例數(shù)為1 684例，其中突變104例，納入文獻(xiàn)的基本特征見表2。

表2 納入文獻(xiàn)的基本情況及質(zhì)量評價結(jié)果

2.3 JAK2基因突變率的Meta分析結(jié)果

納入的15項研究中，I2=90.1%，P<0.1，表明所納入的各研究之間存在異質(zhì)性，故采用隨機效應(yīng)模型合并數(shù)據(jù)。Meta分析結(jié)果顯示JAK2突變率為0.08[95%CI(0.05，0.11)]，表明JAK2突變率具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖 2)。

2.4 敏感性分析結(jié)果

敏感性分析是檢驗在一定條件下所獲結(jié)果穩(wěn)定性的方法，若改變某些結(jié)果的重要因素如納入標(biāo)準(zhǔn)、研究質(zhì)量的差異、失訪情況和效應(yīng)量的選擇等，重新對改變后的變量進(jìn)行meta分析，觀察條件改變后的合并效應(yīng)值是否發(fā)生明顯的變化，從而判斷合并結(jié)果的穩(wěn)定性。若敏感性分析前后合并效應(yīng)量的結(jié)果未發(fā)生較大的變化，則認(rèn)為meta分析的結(jié)果較為可信，若敏感性分析得到不同結(jié)果，則認(rèn)為存在與干預(yù)措施效果有關(guān)的潛在影響因素，因此在下結(jié)論時需要更加謹(jǐn)慎。本次分析采用排除單個研究對象對總效應(yīng)值的影響方法來進(jìn)行敏感性分析。

圖2 CML患者JAK2突變率的森林圖

對納入的15篇文獻(xiàn)采取單項研究依次剔除后，觀察對總合并效應(yīng)量影響的方法進(jìn)行敏感性分析。依次單獨剔除1篇文獻(xiàn)，將剩下的研究重新進(jìn)行合并，圖3展示了合并效應(yīng)量的結(jié)果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lewandowski[10]、Benmoussa[12]、Manjula[23]的研究對合并效應(yīng)量的影響較大，剔除這3項研究后，總的合并效應(yīng)量值分別為 1.132[95%CI(1.084，1.182)]、1.060[95%CI(1.034，1.088)]、1.129[95%CI(1.082，1.179)]，其余研究均勻分布在總合并效應(yīng)量的兩側(cè)，對合并效應(yīng)量的影響不大。

圖3 敏感性分析圖示結(jié)果

2.5 發(fā)表偏倚分析結(jié)果

對所納入的15篇文獻(xiàn)繪制漏斗圖，定性分析發(fā)表偏倚，采用Egger線性回歸定量檢測發(fā)表偏倚，P<0.1，結(jié)果顯示有發(fā)表偏倚(圖4，表3)。

圖4 漏斗圖圖示結(jié)果

2.6 異質(zhì)性分析結(jié)果

本研究所納入的15篇文獻(xiàn)中，均來自不同地區(qū)，有8篇文獻(xiàn)描述的突變位點，有5篇文獻(xiàn)描述CML患者的費城染色體(Ph)，這些在CML的發(fā)生及治療過程中都有重要影響。根據(jù)Ph和JAK2的突變情況、不同地區(qū)的突變分布、不同外顯子突變位點劃分為不同亞組進(jìn)行分析，即Ph+/JAK2+或Ph+/JAK2-或Ph-/JAK2+或Ph-/JAK2-、歐洲組/亞洲組/美洲組/非洲組、外顯子12/外顯子14進(jìn)行比較。

在Ph-/Ph+CML患者與JAK2突變率森林圖中，I2=66%，95%CI(0.53，3.78)(P=0.012)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖5)。不同地區(qū)CML患者與JAK2突變率森林圖中，I2=90.1%，95%CI(0.05，0.11)(P=0.000)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖6)。不同突變位點CML患者與JAK2突變率森林圖中，I2=91.1%，95%CI(0.01，0.02)(P=0.000)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖7)。由此結(jié)果可知，Ph和JAK2是否突變、不同地區(qū)的突變分布、不同外顯子突變位點是總異質(zhì)性的主要來源。

表3 Egger圖示結(jié)果

圖5 Ph-/Ph+CML患者與JAK2突變率森林圖

圖6 不同地區(qū)CML患者與JAK2突變率森林圖

圖7 不同突變位點CML患者與JAK2突變率森林圖

3 討論

慢性髓系白血病(CML)是由BCR-ABL融合基因引起的血液惡性腫瘤，它是費城(Ph)染色體t(9：22)易位的產(chǎn)物[16，25]。易位的結(jié)果是形成BCR-ABL融合基因，產(chǎn)生BCR-ABL蛋白，有證據(jù)提示BCR-ABL蛋白可能直接產(chǎn)生于白血病的形成[26]。BCR-ABL融合蛋白具有持續(xù)活化的酪氨酸激酶活性，引起自身酪氨酸殘基磷酸化及多種蛋白底物磷酸化，從而激活下游多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，如RAS/MAPK途徑、PI3K/AKT途徑、JAK/STAT途徑以及NF-κB途徑，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞分化、凋亡受阻、增殖失控，最終發(fā)生白血病細(xì)胞轉(zhuǎn)化[27-28]。

本研究納入的15篇文獻(xiàn)中，有8篇提及突變體JAKV617F，突變位點分別位于第12號外顯子和第14號外顯子編碼序列的第1 849位堿基G被T取代(表2)。Meta分析結(jié)果顯示JAK2突變率為0.08[95%CI(0.05，0.11)]，表明JAK2突變可能與CML的發(fā)生有關(guān)。由于JAK2是細(xì)胞因子受體，即促紅細(xì)胞生成素受體(EPO-R)和血細(xì)胞生成素受體(TPO-R)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵介質(zhì)，參與造血作用；體外實驗證實JAKV617F能使細(xì)胞增殖活性明顯增強。慢性髓系白血病是一種與染色體畸變相關(guān)的惡性疾病，而JAK2的異常激活與幾種血液系統(tǒng)惡性腫瘤有關(guān)，這些惡性腫瘤可能誘導(dǎo)CML中的染色體易位，最終形成CML。

某些基因表達(dá)異?；蛲蛔兪荂ML患者診斷、分型、研究機制及評估預(yù)后等方面重要的影響因素[10,15]。JAK2發(fā)生突變后，可以通過JAK-STATA信號通路增強紅系祖細(xì)胞的細(xì)胞生存蛋白BCL-X過表達(dá)；同時可能通過影響PL13K、MAPK抑制細(xì)胞死亡受體信號途徑而導(dǎo)致紅系祖細(xì)胞的凋亡[7]；可促進(jìn)造血細(xì)胞系的G1/S期轉(zhuǎn)化，伴細(xì)胞周期蛋白D上調(diào)和抑制因子P27下調(diào)，增強造血細(xì)胞增殖。Lewandowski等[10]的研究顯示在歐洲5名Ph-的CML患者中，確認(rèn)了外顯子12發(fā)生點突變、JAK2V617F突變的存在，并有持續(xù)的血小板增多和/或脾腫大；本研究顯示，外顯子12發(fā)生點突變在JAK2突變中具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Tabassum等[15]的研究顯示，巴基斯坦的CML患者中，Ph+的CML和JAK2V617F突變共存是可能的；本研究顯示，Ph+/-與JAK2的突變率具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

有研究表明，與其他基因相比，JAK2突變和易位與各種造血系統(tǒng)惡性腫瘤密切相關(guān)[24，29]。而本研究也發(fā)現(xiàn)在慢性髓系白血病1 684例患者中有104例患者JAK2發(fā)生突變，突變率達(dá)到8%(P<0.05)。同時，本研究亞組分析也顯示JAK2突變與不同地區(qū)、Ph+/-以及突變位點有關(guān)。

本研究存在以下局限性：本研究的部分納入文獻(xiàn)病例數(shù)相對較小，這可能給Meta分析的結(jié)果造成一定的異質(zhì)性，從而影響Meta分析的結(jié)果。本研究納入的文獻(xiàn)均為公開發(fā)表的文獻(xiàn)，可能會導(dǎo)致發(fā)表偏倚。