李若婉，周長慧，黃鵬程，常 艷*

(中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院國家上海新藥安全評價研究中心，上海益諾思生物技術(shù)股份有限公司，上海 201203)

遺傳毒性的危害識別和風(fēng)險評估在臨床前化學(xué)品和藥品的安全性評價中起著至關(guān)重要的作用。目前監(jiān)管機(jī)構(gòu)已通過一系列用于遺傳毒性誘變劑檢測的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)檢測系統(tǒng)，體外試驗(yàn)包括基于細(xì)菌試驗(yàn)的Ames試驗(yàn)，基于哺乳動物細(xì)胞的tk基因突變試驗(yàn)以及HPRT基因突變試驗(yàn)；體內(nèi)試驗(yàn)包括轉(zhuǎn)基因動物試驗(yàn)，例如MutaTMMouse、BigBlueTM小鼠和Xenomouse小鼠轉(zhuǎn)基因突變試驗(yàn)。

近年來，基于內(nèi)源性磷脂酰肌醇聚糖A類基因(phosphatidylinositol glycan class-A，人類為PIG-A基因，嚙齒類動物為Pig-a基因)在嚙齒類動物中開發(fā)了另一種體內(nèi)基因突變的檢測方法[1]。細(xì)胞中PIG-A基因發(fā)生突變可導(dǎo)致細(xì)胞表面糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)錨的合成障礙并導(dǎo)致其錨鏈蛋白缺失。參與GPI錨合成的30多個基因中只有PIG-A基因位于X染色體。在胚胎發(fā)育中，兩條X染色體中的一條隨機(jī)滅活，因此一旦PIG-A基因發(fā)生突變，即可導(dǎo)致GPI錨合成障礙，并導(dǎo)致細(xì)胞表面錨蛋白(例如CD48、CD55、CD59、CD90)缺失[2]。嚙齒類動物外周血Pig-a基因突變試驗(yàn)就是基于流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血細(xì)胞表面GPI錨鏈蛋白的缺失，推斷Pig-a基因是否發(fā)生突變，進(jìn)而判定受試物是否具有致突變性。該方法在美國、歐洲和日本均已開展聯(lián)合驗(yàn)證，證實(shí)其可與其他遺傳學(xué)試驗(yàn)終點(diǎn)結(jié)合綜合評價受試物的遺傳毒性，也可以整合至一般毒理學(xué)研究中[3]。

體外PIG-A基因突變檢測方法是基于PIG-A基因物種保守性開發(fā)的，該方法既符合3R原則，又可以作為嚙齒類動物Pig-a基因突變檢測方法的補(bǔ)充[4]。Krüger等[5]率先使用了人成淋巴母細(xì)胞系TK6細(xì)胞，建立了通過流式細(xì)胞術(shù)檢測TK6細(xì)胞中GPI(-)頻率的方法。之后Rees等[6]對比了TK6細(xì)胞和MCL-5細(xì)胞應(yīng)用于PIG-A基因突變試驗(yàn)的利弊，同時對流式細(xì)胞術(shù)的檢測方法進(jìn)行了優(yōu)化。在Pig-a基因型與表型關(guān)系的研究中[7]已表明人PIG-L基因與PIG-A基因在TK6細(xì)胞GPI錨蛋白缺失中均發(fā)揮重要作用。McKinzie等[8]通過全基因組測序預(yù)測小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞系亦適合于體外Pig-a檢測方法的開發(fā)，且有研究相繼開發(fā)并驗(yàn)證了L5178Y細(xì)胞系的體外Pig-a檢測方法[9-11]。本研究的目的是采用p53基因完整的人成淋巴TK6細(xì)胞為試驗(yàn)體系，采用免疫磁珠分離的方法清除TK6細(xì)胞中預(yù)先存在的GPI(-)細(xì)胞并測定TK6細(xì)胞的自發(fā)GPI(-)頻率，然后以甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone，EMS)與苯并芘(benzo[a]pyrene，B[a]P)為陽性對照品，建立基于流式細(xì)胞術(shù)的體外PIG-A基因突變檢測方法，探討其應(yīng)用于藥物遺傳毒性早期篩選和評價的潛力。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

人成淋巴TK6細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection， ATCC)； 苯 并 芘 、甲基磺酸乙酯、多聚甲醛和放線菌素D均購自Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、熱滅活馬血清、PBS和L-谷氨酰胺購自Gibco公司；APC鼠抗人CD19抗體(貨號561742)、PE鼠抗人CD55抗體(貨號341030)、PE鼠抗人CD59抗體(貨號560953)和核酸染料7-氨基放線菌素D(7-Aminoactinomycin D，7-AAD)(貨號 559925)均購自BD Bioscience公司；牛白蛋白(BSA)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大鼠肝S9購自美國Moltox公司；肝S9輔助因子為本實(shí)驗(yàn)室制備的儲備液；anti-PE磁珠、MACS分選柱和MACS分選器均購自Miltenyi Bioscience公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀為丹麥Chemometec(型號NucleoCounter?NC-100)； 流 式 細(xì) 胞 儀 為 BD 公 司AccuriTMC6 PLUS。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) TK6細(xì)胞培養(yǎng)于含10%熱滅活馬血清和2 mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，加濕條件下懸浮培養(yǎng)。每周傳代2~3次，細(xì)胞密度維持在0.8×105~1.0×106/mL之間。

1.2.2 受試物和體外代謝活化系統(tǒng) EMS和B[a]P均以二甲亞砜(DMSO)為溶劑配制終濃度100倍的儲備液，同時以1%DMSO作為本試驗(yàn)的陰性對照品。

體外代謝活化系統(tǒng)是大鼠肝S9和輔助因子的混合物，臨用前新鮮配制，保存于冰上。大鼠肝S9在培養(yǎng)液中的終濃度為1%(V/V)。

1.2.3 清除TK6細(xì)胞中預(yù)先存在的GPI(-)細(xì)胞 傳代培養(yǎng)的TK6細(xì)胞，計(jì)數(shù)后取約2×106個細(xì)胞，加入PBS洗滌1次。4℃、150 g離心5 min，棄去上清液，加入抗體染液 180 μL(含 CD19 抗體 40 μL、CD55抗體24 μL、CD59抗體40 μL以及2%BSA的PBS溶液)，2~8℃避光孵育30 min。使用預(yù)冷的PBS緩沖液(含2%BSA)漂洗細(xì)胞。加入含anti-PE-微珠的PBS緩沖液(含2%BSA)，2~8℃避光孵育30 min，加入預(yù)冷的PBS緩沖液(含2%BSA)將細(xì)胞重懸。隨后，使用MACS分選柱和MACS分選器分離anti-PE-微珠標(biāo)記的PIG-A基因野生型[即GPI(+)細(xì)胞]和PIG-A基因突變型[即GPI(-)細(xì)胞]，收集吸附在分選柱中的TK6細(xì)胞，即GPI(+)細(xì)胞。最后，將分離獲得的TK6細(xì)胞重新懸浮至RPMI-1640培養(yǎng)基中傳代并擴(kuò)大培養(yǎng)。使用流式細(xì)胞儀測定擴(kuò)大培養(yǎng)TK6細(xì)胞中PIG-A基因的基礎(chǔ)突變率，即GPI(-)細(xì)胞頻率(CD55-CD59-/CD19+細(xì)胞群在CD19+細(xì)胞群中的頻率)。

若基礎(chǔ)突變率仍然較高(≥7.5×10-5)，可重復(fù)清除過程?；A(chǔ)突變率合格的TK6細(xì)胞，擴(kuò)增后進(jìn)行凍存。后續(xù)新復(fù)蘇的細(xì)胞傳代時間不超過3~4周。所有操作步驟均在冰上避光進(jìn)行。

1.2.4 TK6細(xì)胞中自發(fā)GPI(-)頻率測定 將已清除預(yù)存GPI(-)細(xì)胞的TK6細(xì)胞維持0.8×105~1.0×106/mL的濃度傳代培養(yǎng)，每4 d測定PIG-A基因突變頻率。依據(jù)Glaab以及Tindall描述的方法計(jì)算GPI(-)細(xì)胞自發(fā)產(chǎn)生的頻率[12]。以TK6細(xì)胞中GPI(-)頻率為縱坐標(biāo)，以傳代培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)繪制圖形，線性回歸分析后，得到的斜率值/4，即為自發(fā)的GPI(-)頻率。

1.2.5 EMS和B[a]P的體外PIG-A試驗(yàn) 受試物信息及濃度設(shè)置見表1。方法建立試驗(yàn)均使用已清除預(yù)存GPI(-)細(xì)胞的TK6細(xì)胞。

表1 受試物信息及濃度選擇

24 h-S9和4 h+S9處理組分別選擇EMS和B[a]P作為陽性對照。T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中分別加入陰性對照品或陽性對照品(加樣體積1%)和細(xì)胞濃度為3.0×105/mL的細(xì)胞懸液10 mL，混勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)(第1天)，其中+S9組細(xì)胞培養(yǎng)液中加入S9工作液，使S9的終濃度為1%。每個處理?xiàng)l件設(shè)置2個重復(fù)樣。其中+S9處理組，細(xì)胞暴露于B[a]P 4 h后，將細(xì)胞用不含血清的培養(yǎng)基或PBS洗滌，之后加入1640完全培養(yǎng)基重懸后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。-S9處理組，細(xì)胞直接暴露于EMS，連續(xù)處理24 h。

1.2.6 相對細(xì)胞增長數(shù)的測定 B[a]P和EMS組培養(yǎng)24 h后，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，計(jì)算相對細(xì)胞增長數(shù)(relative increase in cell count，RICC)，用于受試物對細(xì)胞作用的評價。同時，每瓶取2×106個細(xì)胞，加入PBS緩沖液漂洗細(xì)胞，150 g離心5 min，棄上清。加入25 mL 1640完全培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度至0.8×105/mL。將細(xì)胞接種到T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。表達(dá)期細(xì)胞在第2、4、6、8、10天分別使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算每個處理組在表達(dá)期內(nèi)的RICC變化并且每次傳代調(diào)整細(xì)胞濃度至0.8×105/mL傳代培養(yǎng)(不足0.8×105/mL時，按照原濃度接種)，第10天調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL傳代。RICC計(jì)算公式如下：

*：接種細(xì)胞濃度為每次調(diào)整接種時的細(xì)胞濃度。

1.2.7 抗體標(biāo)記及流式細(xì)胞術(shù)分析 在流式細(xì)胞術(shù)分析當(dāng)天(第11天)，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞。取陰性對照組細(xì)胞5份，每份1×106細(xì)胞。其中1份作為空白對照不進(jìn)行抗體孵育，1份進(jìn)行全抗體孵育(同1.2.3所示方法)，另3份用于單一抗體染色180 μL孵育標(biāo)記(分別僅標(biāo)記CD19，CD55和CD59，核酸)。孵育完成單色標(biāo)記的細(xì)胞后，加入600 μL固定液(含2.5 μg/mL放線菌素D、1%甲醛的PBS溶液)重懸細(xì)胞。每個樣品取100 μL，混勻后，制備成為模擬樣品。

PIG-A突變頻率檢測時，每個處理組取2×106個細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管，150 g離心5 min，棄上清后加入PBS緩沖液漂洗。漂洗后，將細(xì)胞加入到抗體染液中(配制方法同1.2.3所示)輕輕混勻置于冰上避光孵育30 min，加入預(yù)冷的PBS緩沖液(含2%BSA)漂洗細(xì)胞。每管加入核酸染液(含1 μg/mL 7-AAD的PBS溶液)，置于冰上孵育10 min。漂洗細(xì)胞后加入600 μL固定液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至流式管，置于冰上或2~8℃待流式分析。過程如下：首先使用制備的3份單一抗體染色樣品、一份空白樣品和1份全染色樣品進(jìn)行模板建立。使用流式細(xì)胞儀逐個分析空白細(xì)胞樣品，僅標(biāo)記APC-CD19細(xì)胞樣品，標(biāo)記PE-CD55和PE-CD59細(xì)胞樣品和僅標(biāo)記7-AAD細(xì)胞樣品，調(diào)節(jié)FL2-FL4、FL2-FL3和FL3-FL4熒光通道間補(bǔ)償。最后分析模擬樣品用于流式散點(diǎn)圖的十字門位置確定。模板設(shè)立完成后，使用全染色樣品驗(yàn)證建立的模板，并進(jìn)行EMS和B[a]P處理樣品及陰性樣品的檢測。設(shè)置流式細(xì)胞儀終止條件為：分析總細(xì)胞達(dá)到1×106個或分析樣品體積達(dá)到400 μL。

1.2.8 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 每組PIG-A基因突變率[即GPI(-)細(xì)胞頻率]以 xˉ± s表示。至少一個濃度的GPI(-)細(xì)胞頻率與陰性對照相比有2倍及以上增加且呈現(xiàn)濃度-效應(yīng)關(guān)系，則判定為陽性結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 清除預(yù)先存在的GPI(-)TK6細(xì)胞

經(jīng)過兩次清除，本實(shí)驗(yàn)室TK6細(xì)胞中GPI(-)細(xì)胞的背景值由23.4%降低至2.5×10-5，符合文獻(xiàn)建議的TK6細(xì)胞PIG-A基礎(chǔ)突變率范圍5×10-6~7.5×10-5[5]，見圖1。

圖1 清除TK6細(xì)胞中預(yù)先存在GPI(-)細(xì)胞的情況

2.2 TK6細(xì)胞的自發(fā)GPI(-)率

自發(fā)GPI(-)率表示每天細(xì)胞分裂時自發(fā)產(chǎn)生GPI(-)細(xì)胞的頻率。為了評估TK6細(xì)胞系的自發(fā)GPI(-)率，本試驗(yàn)每隔4 d測定GPI(-)率至第40天(后兩次間隔8 d檢測)。由GraphPad Prism 7軟件擬合出自發(fā)GPI(-)率曲線，計(jì)算得出，自發(fā)GPI(-)率為每天5.04×10-7個。自發(fā)GPI(-)頻率擬合曲線見圖2。

圖2 TK6細(xì)胞自發(fā)GPI(-)頻率擬合曲線

2.3 相對細(xì)胞增殖

使用表達(dá)24 h的RICC評價受試物對細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果見圖3。計(jì)算得出100 μmol/L EMS處理24 h后的RICC為45.13%(圖3A)。16 μmol/L B[a]P處

理4 h并繼續(xù)培養(yǎng)至24 h的RICC為31.86%(圖3B)。

圖3 EMS和B[a]P作用24 h后的RICC曲線

2.4 EMS和B[a]P的體外PIG-A基因突變試驗(yàn)

模板建立及樣品檢測流式圖見圖4。EMS 50、75和100 μmol/L各濃度組在-S9代謝系統(tǒng)條件下持續(xù)處理TK6細(xì)胞24 h。與陰性對照組相比，第11天的GPI(-)頻率呈現(xiàn)濃度-效應(yīng)相關(guān)性增加；其中75和100 μmol/L組GPI(-)頻率增加2倍以上(圖5A)。

B[a]P 4、8和16 μmol/L濃度組+S9代謝系統(tǒng)條件下持續(xù)處理TK6細(xì)胞4 h。與陰性對照組相比，第11天的GPI(-)頻率呈現(xiàn)濃度-效應(yīng)相關(guān)性增加；其中8和16 μmol/L組GPI(-)頻率增加4倍以上(圖5B)。

圖4 流式檢測模板及樣品檢測流式圖

圖5 EMS和B[a]P與TK6細(xì)胞作用后GPI(-)頻率

2.5 EMS和B[a]P的突變表達(dá)期RICC

合適的細(xì)胞毒性選擇對遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果的判定至關(guān)重要，毒性表征不合適會導(dǎo)致與遺傳毒性無關(guān)的假陽性結(jié)果[13]。本試驗(yàn)使用毒性表征參數(shù)24 h RICC評估了經(jīng)EMS和B[a]P處理24 h后以及10 d表達(dá)期間的細(xì)胞毒性。EMS處理TK6細(xì)胞后，與對照組相比，48 h后的RICC降至最低(圖6A)，之后隨著細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，RICC值逐步升高。在表達(dá)期結(jié)束時，RICC值接近100%。而B[a]P處理TK6細(xì)胞后，與對照組相比，24 h后RICC降至最低(見圖6B)。之后隨著細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，RICC值逐步升高。

3 討論

本試驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀分析EMS和B[a]P誘導(dǎo)TK6細(xì)胞產(chǎn)生的PIG-A基因突變結(jié)果均為陽性，提示本實(shí)驗(yàn)室初步建立了基于TK6細(xì)胞的體外PIG-A基因突變試驗(yàn)方法。后續(xù)，我們將應(yīng)用多種機(jī)制的遺傳毒性物質(zhì)和非遺傳毒性物質(zhì)來繼續(xù)驗(yàn)證該方法的靈敏度和特異性。

圖6 PIG-A基因10 d突變表達(dá)期RICC

試驗(yàn)選擇人成淋巴TK6細(xì)胞，該細(xì)胞系起源于人造血系統(tǒng)，可懸浮培養(yǎng)并且具有完整的p53基因功能，在遺傳毒性試驗(yàn)中具有較高的靈敏度和特異性，可減少試驗(yàn)結(jié)果的假陽性[14]。但是，由于TK6細(xì)胞自發(fā)突變率較高，該細(xì)胞用于基因突變檢測時對TK6細(xì)胞的傳代次數(shù)要求較高，一般在復(fù)蘇后傳代10 d內(nèi)開展實(shí)驗(yàn)。此外，長期凍存的TK6細(xì)胞在復(fù)蘇傳代后，需再次清除傳代細(xì)胞中預(yù)先存在的突變細(xì)胞，以降低基礎(chǔ)突變值，提高試驗(yàn)的靈敏度。同時，該細(xì)胞不表達(dá)代謝酶，在評價一些需經(jīng)代謝活化的前致癌物時，需添加S9。因此，雖然TK6細(xì)胞本身在種屬上優(yōu)勢巨大，但在試驗(yàn)可操作性上存在缺陷，未來可能需要測試更多的細(xì)胞株用于PIG-A基因突變試驗(yàn)，以獲得自發(fā)突變率低、具有代謝能力和p53基因功能完善的人源化細(xì)胞用于該試驗(yàn)。

為了提高試驗(yàn)系統(tǒng)檢測誘變劑的靈敏度，試驗(yàn)開始前需清除TK6細(xì)胞中預(yù)先存在的GPI(-)細(xì)胞。然而，流式細(xì)胞儀分選成本高，耗時較長，操作較復(fù)雜；免疫吸附分離方法分離效果較低；單細(xì)胞克隆分離方法耗時較長，操作復(fù)雜；抗體包被平皿吸附分離方法分離效率較低。嚙齒類動物體內(nèi)Pig-a基因突變試驗(yàn)中，Dertinger等[15]提出了利用免疫磁珠分離富集嚙齒類動物紅細(xì)胞Pig-a基因突變細(xì)胞的方法。本試驗(yàn)利用該分離原理嘗試進(jìn)行清除試驗(yàn)，最后通過洗滌收集MACS分選柱吸附的GPI(-)細(xì)胞，使長期傳代培養(yǎng)的TK6細(xì)胞中GPI(-)背景值從分離前的23.4%降低到2.5×10-5。清除試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法能以較高的分離效率去除人成淋巴TK6細(xì)胞中預(yù)存的GPI(-)細(xì)胞，此法不但分離效果好，而且操作簡單、成本低廉、耗時短。

綜上所述，相較于現(xiàn)有的基因突變檢測方法，體外PIG-A基因突變檢測方法操作簡單、樣品制備速度快、具有較短的試驗(yàn)周期、使用流式細(xì)胞儀檢測可實(shí)現(xiàn)高通量檢測；另一方面可以作為體內(nèi)PIG-A基因突變試驗(yàn)的補(bǔ)充試驗(yàn)和其他致突變試驗(yàn)陽性結(jié)果的追加試驗(yàn)，具有應(yīng)用于藥物開發(fā)早期遺傳毒性篩選和評價的潛力。