王曉杰，滕 宇，顧 勐，王子宇，趙曉婷，岳文濤*

(1．首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院/北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所細(xì)胞生物學(xué)研究室，北京 101149；2．首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100026)

乳腺癌(breast cancer)是全球最常見(jiàn)的女性腫瘤[1]，是女性癌癥死亡的主要原因，約11%的乳腺癌發(fā)生在中國(guó)，而且近幾十年來(lái)發(fā)病率及死亡率迅速上升[2]，其發(fā)生發(fā)展機(jī)制涉及諸多腫瘤相關(guān)基因的異常表達(dá)。事實(shí)上，在臨床表現(xiàn)之前，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移性播散的最主要事件是細(xì)胞遷移，這也是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程的核心[3]。大多數(shù)乳腺癌患者死于多器官轉(zhuǎn)移的晚期，是臨床治療失敗的主要原因。Rho相關(guān)蛋白激酶(Rho-associated protein kinase，ROCK)大約在20年前首次被發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞遷移中起作用[4]，它參與了幾乎所有的遷移模式[5-6]。ROCK通過(guò)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性和運(yùn)動(dòng)性而顯著促進(jìn)轉(zhuǎn)移[6-7]。因此Rho/ROCK通路通過(guò)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組參與腫瘤發(fā)展進(jìn)程。已有研究[8-9]報(bào)道，特定的ROCK抑制劑可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。ROCK1是小型G蛋白GTPase RhoA的下游效應(yīng)物，通過(guò)肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)的磷酸化調(diào)節(jié)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，從而促進(jìn)應(yīng)力纖維的形成，增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷移能力[10]。由此可見(jiàn)，ROCK1可能在腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲中發(fā)揮作用。但在各種腫瘤中的作用和相關(guān)機(jī)制還有待明確。

本研究中，我們通過(guò)成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9，CRISPR/Cas9)[11]技術(shù)在MCF-7乳腺癌細(xì)胞系中構(gòu)建穩(wěn)定的ROCK1基因敲除細(xì)胞模型，為后續(xù)鑒定ROCK1直接調(diào)控的靶基因，研究其參與乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

Oligo引物(Generay Biotech)，2×Taq Plus Master Mix(Vazyme P212-03)，BsmB I(賽默飛)，T4 DNA 連接酶(Fermentas EL0016)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒均購(gòu)自TIANGEN公司，胰蛋白胨和瓊脂粉均購(gòu)自O(shè)XOID公司，嘌呤霉素和瓊脂糖購(gòu)自Sigma公司，DTT二硫蘇糖醇(Sangon D0281-5g)，胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco，引物、TOP10感受態(tài)、ROCK基因敲除慢病毒、Polybrene感染增強(qiáng)劑均購(gòu)自Genechem公司，人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7源自醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所細(xì)胞資源中心，ROCK1兔源單抗和HRP標(biāo)記的GAPDH單抗購(gòu)自Abcam公司。

主要儀器包括：電泳儀(Tanon EPS-600)，Alpha凝膠成像分析系統(tǒng)(FluorChemTMSP)，搖床(華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司HI-9211K)，GHP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，PCR儀(Applied Biosystems 2720 thermal)，高速離心機(jī)(Thermo cycler 17)，微型掌式離心機(jī)(GeneSci mini-6k)。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

針對(duì)目的基因靶基因序列，設(shè)計(jì)向?qū)NA(small guide RNA，sgRNA)靶點(diǎn)序列，靶點(diǎn)序列分別為L(zhǎng)VROCK1-sgRNA-1(ATCCGAATTCACTTCCGATT)、LVROCK1-sgRNA-2(CTTCATAGCATATACCTTCC)、LVROCK1-sgRNA-3(TTAGGATGGATTGGATGCTT)及對(duì)照病毒LV-NC的隨機(jī)序列(CGCTTCCGCGGCCCGT TCAA)。載體兩端BsmB I酶切位點(diǎn)序列如下：CACCGGAGACGCGTCTCT/GTTT，GTGGCCTCTGCG CAGAGACAAA/(斜線表示酶切產(chǎn)生的黏端，方向相同的斜線對(duì)應(yīng)雙鏈的互補(bǔ)堿基，下劃線表示互補(bǔ)序列)，設(shè)計(jì)原理為在sgRNA兩端加入BsmB I位點(diǎn)切割后產(chǎn)生的互補(bǔ)黏端，對(duì)GV392載體進(jìn)行酶切，使其線性化，反應(yīng)體系：GV392質(zhì)粒(1 μg/μL)2 μL，10×酶切緩沖液 2 μL，DTT(20 mmol/μL)1 μL，BsmB I酶 1 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL；反應(yīng)條件：37℃酶切3 h。由引物合成公司合成單DNA oligo(PAGE純化)，線性化的載體DNA與退火的DNA雙鏈進(jìn)行連接，連入Lenti-CAS9-sgRNA-tag載體(Puromycin耐藥標(biāo)簽)。反應(yīng)體系及條件如下：線性化的載體DNA(50 ng/μL)2 μL，退火的雙鏈DNA 0.5 μL，10×T4緩沖液1 μL，pEG4000 1 μL，T4 DNA 連接酶1 μL，ddH2O補(bǔ)足至10 μL；16℃反應(yīng)3 h。將連接好的產(chǎn)物冰浴30 min后轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，吸取適量菌液均勻涂布在Amp抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)過(guò)夜，次日進(jìn)行菌落PCR鑒定。菌落PCR得到陽(yáng)性克隆后測(cè)序，從而得到序列正確的表達(dá)sgRNA的過(guò)表達(dá)慢病毒質(zhì)粒。

1.3 重組質(zhì)粒的鑒定

在超凈工作臺(tái)中，以無(wú)菌吸頭挑取單個(gè)菌落至微型管中進(jìn)行PCR鑒定，反應(yīng)體系為：上游引物(10 μmol/L)0.5 μL，下游引物(10 μmol/L)0.5 μL，2×Taq Plus Master Mix 10 μL，模板菌落，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增循環(huán)反應(yīng)條件為94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、90 s，共22個(gè)循環(huán)。上游引物序列采用質(zhì)粒共有序列：5'-CCATGATTCCTTCATA TTTGC-3'，即 Primer(+)；下游引物序列采用sgRNA的oligo序列(5'-CGCGTGGATAACCGTATTAC-3')為反義鏈，即Primer(-)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性菌落接種于200 μL含氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)2 h，取適量菌液進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.4 慢病毒感染及細(xì)胞模型的篩選

人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。感染前一天，消化MCF-7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至3×104個(gè)/mL，每孔200 μL接種至96孔板。次日根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的病毒復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)值，用含有感染增強(qiáng)劑聚凝胺的細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋病毒，每孔加入100 μL病毒稀釋液感染上述乳腺癌細(xì)胞，感染8 h后更換常規(guī)培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h后，換成含嘌呤霉素(3 μg/mL)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，對(duì)病毒感染細(xì)胞進(jìn)行篩選，最終獲得慢病毒感染且穩(wěn)定敲除ROCK1基因的目的乳腺癌細(xì)胞株。

1.5 Western blot檢測(cè)

將細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，并分別收集穩(wěn)定敲除ROCK1基因的乳腺癌細(xì)胞株、MCF-7親本細(xì)胞以及陰性對(duì)照組細(xì)胞(LV-NC)，加入適量混勻的蛋白裂解液。蛋白裂解液的配制比例為每100萬(wàn)細(xì)胞內(nèi)加入100 μL RIPA裂解液、1 μL cooktail、1 μL膽堿脂酶抑制劑PMSF以及二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol，DTT，稀釋1 000倍使用)，充分震蕩，12 000 r/min 4℃離心15 min，取上清液經(jīng)BCA蛋白定量檢測(cè)法測(cè)定樣品濃度，按照與上樣蛋白體積1∶4的比例加入含β-巰基乙醇的5×上樣緩沖液，混勻后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳結(jié)束，經(jīng)恒流電泳轉(zhuǎn)移、5%脫脂牛奶封閉、兔源一抗孵育、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育、0.1%TBST洗膜、ECL化學(xué)發(fā)光等步驟，在Alpha凝膠成像分析系統(tǒng)(FluorChemTMSP)中曝光圖像并分析結(jié)果。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的穩(wěn)定敲除ROCK1基因的乳腺癌細(xì)胞株及對(duì)照組細(xì)胞株用胰酶消化后計(jì)數(shù)，接種于6孔板，接種數(shù)量以次日鋪滿6孔板一層為宜。接種24 h后，在6孔板中劃痕，生理鹽水沖洗3次，更換含有0.2%牛血清白蛋白(albumin from bovine serum，BSA)的DMEM培養(yǎng)基，分別于劃痕后0、12、24 h觀察細(xì)胞的遷移情況并拍照記錄，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)

不鋪膠：將處于對(duì)數(shù)期的穩(wěn)定敲除ROCK1基因的乳腺癌細(xì)胞株及對(duì)照組細(xì)胞株接種于25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，24 h后換成含有0.2%BSA的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，另將小室置于24孔板中，上室中加入100 μL含有0.2%BSA的DMEM培養(yǎng)基，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基平衡過(guò)夜。次日消化，計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL，取100 μL加入上室。24 h后用2%龍膽紫將小室染色30 min，洗凈，將小室的膜取下，封片拍照。

鋪膠：將小室置于24孔板中，上室中加入50 μL含有0.2%BSA的DMEM培養(yǎng)基經(jīng)1∶5稀釋的基質(zhì)膠，37℃溫箱過(guò)夜。次日，在上室中加入100 μL含有0.2%BSA的DMEM培養(yǎng)基，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，水化30 min后加入100 μL細(xì)胞稀釋液(5×105個(gè)/mL)，48 h后用2%龍膽紫將小室染色30 min，洗凈，將小室的膜取下，封片拍照，其余步驟同上。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均至少獨(dú)立重復(fù)3次；應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，圖像分析所得相對(duì)灰度值以xˉ±s表示，兩樣本均數(shù)之間采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 ROCK1質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

針對(duì)目的基因靶基因序列，設(shè)計(jì)sgRNA靶點(diǎn)序列，單鏈DNA oligo兩端含酶切位點(diǎn)黏端，經(jīng)退火處理形成雙鏈DNA，連入Lenti-CAS9-sgRNA-tag載體(GV392、Puromycin藥物篩選標(biāo)記，圖1A)。將連接好的產(chǎn)物使用TOP10感受態(tài)轉(zhuǎn)化，菌落PCR得到陽(yáng)性克隆后測(cè)序，從而得到序列正確、表達(dá)sgRNA的過(guò)表達(dá)慢病毒質(zhì)粒，然后進(jìn)行慢病毒的包裝。LV-ROCK1-sgRNA-1(圖 1B)、LV-ROCK1-sgRNA-2(圖 1C)和 LVROCK1-sgRNA-3(圖1D)的質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果正確。

2.2 穩(wěn)定敲除乳腺癌細(xì)胞株中ROCK1的鑒定

為檢驗(yàn)ROCK1基因敲除后，細(xì)胞株中ROCK1蛋白的表達(dá)情況，對(duì)LV-ROCK1-sgRNA-1/2/3和陰性對(duì)照(LV-NC)及未經(jīng)感染的MCF-7細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測(cè)(圖2)。在被LV-NC感染的對(duì)照組細(xì)胞及親本細(xì)胞MCF-7中檢測(cè)到特異性ROCK1蛋白條帶，分子量約165 kD，在LV-ROCK1-sgRNA-1、LV-ROCK1-sgRNA-2感染的MCF-7細(xì)胞的對(duì)應(yīng)位置可見(jiàn)到明顯減弱的蛋白條帶，而在LV-ROCK1-sgRNA-3感染的MCF-7細(xì)胞對(duì)應(yīng)位置未見(jiàn)到明顯蛋白條帶，表明ROCK1敲除乳腺癌細(xì)胞模型構(gòu)建成功。后續(xù)研究使用LV-ROCK1-sgRNA-3敲除ROCK1基因的細(xì)胞模型作為實(shí)驗(yàn)組；LV-NC感染的細(xì)胞作為對(duì)照組。

2.3 ROCK1敲除對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。ROCK1敲除細(xì)胞株24 h劃痕愈合度為(60.600±0.047)%，對(duì)照組細(xì)胞24 h劃痕愈合度為(80.404±0.018)%，提示ROCK1敲除細(xì)胞株在24 h內(nèi)劃痕愈合面積較對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。

圖1 ROCK1質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

圖2 MCF-7細(xì)胞中敲除ROCK1的表達(dá)情況

Transwell結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示在不鋪膠情況下，實(shí)驗(yàn)組ROCK1敲除細(xì)胞株在24 h的遷移細(xì)胞數(shù)為(448.3±5.5)個(gè)，對(duì)照組的遷移細(xì)胞數(shù)為(271.3±5.0)個(gè)，提示ROCK1敲除細(xì)胞株在24 h內(nèi)穿過(guò)小室底膜的細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。提示ROCK1敲除可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7的遷移能力。

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析

在鋪膠情況下，實(shí)驗(yàn)組中ROCK1敲除細(xì)胞株48 h內(nèi)的遷移細(xì)胞數(shù)為(1.7±2.9)個(gè)，對(duì)照組的遷移細(xì)胞數(shù)為(298.3±5.7)個(gè)，提示ROCK1敲除細(xì)胞株在48 h時(shí)內(nèi)穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。說(shuō)明ROCK1敲除可明顯抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的侵襲能力。

3 討論

乳腺癌患者的死亡率呈逐年上升的態(tài)勢(shì)，腫瘤轉(zhuǎn)移是大多數(shù)癌癥患者死亡的主要原因[12]。腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移是腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程的核心環(huán)節(jié)。小GTPase Rho家族通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)的功能在腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。ROCK1作為小型GTPase Rho家族主要的下游效應(yīng)物，是激活Rho的主要介體，也是促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展過(guò)程的重要因素[13-17]。Bottino等[14]用免疫組化的方法對(duì)乳腺癌腫瘤碎片中的ROCK1進(jìn)行染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中ROCK1蛋白含量遠(yuǎn)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，ROCK1蛋白的表達(dá)量與臨床分期及有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移也密切相關(guān)。除乳腺癌外，Vigil等[15]的研究表明，ROCK1作為非小細(xì)胞肺癌侵襲及轉(zhuǎn)移的重要因素，可以作為治療非小細(xì)胞肺癌的重要靶點(diǎn)。Sahai等[16]研究表明Rho GTPases調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架和細(xì)胞遷移，在腫瘤中過(guò)表達(dá)，ROCK1也是其他癌癥[17]細(xì)胞運(yùn)動(dòng)/侵襲的關(guān)鍵因素。

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)，應(yīng)用乳腺癌細(xì)胞株MCF-7構(gòu)建ROCK1敲除細(xì)胞模型，通過(guò)DNA測(cè)序和Western blot證實(shí)ROCK1基因敲除細(xì)胞模型構(gòu)建成功，進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)研究ROCK1敲除細(xì)胞模型對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。在用Western blot驗(yàn)證細(xì)胞模型是否構(gòu)建成功的結(jié)果中(圖2)，被LV-ROCK1-sgRNA-1或LV-ROCK1-sgRNA-2感染的MCF-7細(xì)胞仍存在減弱的蛋白條帶，這表示插入的干擾序列未能完全抑制ROCK1蛋白的表達(dá)。在LV-ROCK1-sgRNA-3感染的MCF-7細(xì)胞的對(duì)應(yīng)位置未見(jiàn)到明顯蛋白條帶，表明ROCK1敲除乳腺癌細(xì)胞模型構(gòu)建成功。在劃痕實(shí)驗(yàn)以及Transwell實(shí)驗(yàn)中，與LV-NC對(duì)照組相比，被LV-ROCK1-sgRNA-3感染的細(xì)胞在侵襲及轉(zhuǎn)移方面的能力顯著降低。

綜上所述，區(qū)別于其他應(yīng)用抑制劑抑制ROCK1作用的研究實(shí)驗(yàn)，本研究用Cas9的方法敲除了ROCK1基因，探究ROCK1基因的敲除對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)，本研究發(fā)現(xiàn)相較于對(duì)照組，ROCK1基因敲除的細(xì)胞株遷移和侵襲能力明顯減弱，ROCK1基因的失活突變可以抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他研究的觀點(diǎn)相符，說(shuō)明ROCK1在乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，為后續(xù)鑒定ROCK1直接調(diào)控的靶基因，研究其參與乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制建立了穩(wěn)定的細(xì)胞模型。