孫曉男，苑 青，楊荔艷，張 鈺，蔡 巖，徐 昕，王明榮，郝佳潔，*，賈雪梅*

(1．安徽醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室，安徽合肥 230032；2．國家癌癥中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，北京 100021)

食管癌是人類消化道惡性腫瘤之一。食管癌的主要病理類型包括食管鱗癌和食管腺癌。中國人群最常見的病理類型為食管鱗癌[1-2](以下簡稱“食管癌”)。在中國，食管癌的發(fā)病率在惡性腫瘤中排名第5，死亡率排名第4[3]，某些地區(qū)仍是世界上食管癌發(fā)病率最高的地區(qū)之一[4]。食管癌是一種進(jìn)展迅速、預(yù)后較差的惡性腫瘤。一旦被診斷為食管癌，超過50%的患者為晚期腫瘤或伴有影像學(xué)上可見的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移瘤[5]。雖然大部分食管癌患者可以通過手術(shù)治療，但仍有許多患者死于局部復(fù)發(fā)、病情進(jìn)展及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[6]。食管癌患者(包括食管腺癌患者)的總體5年生存率僅為15%~25%[7]。病理分期可以作為臨床預(yù)后判斷指標(biāo)，但相同分期患者的預(yù)后可能存在很大差異，因此尋找與食管癌預(yù)后有關(guān)的分子標(biāo)志物，對于食管癌患者臨床治療和提高生存率具有重要意義。

FGFBP2屬于纖維母細(xì)胞生長因子結(jié)合蛋白家族基因，編碼KSP37蛋白。據(jù)報道，KSP37蛋白是由細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞CTL和NK細(xì)胞選擇性分泌的。KSP37蛋白表達(dá)升高與輕度外源性哮喘密切相關(guān)[8-9]。研究表明，F(xiàn)GFBP在致癌物誘導(dǎo)的皮膚狀細(xì)胞癌和一些結(jié)腸腫瘤組織中高表達(dá)[10]。Yamanaka等[11]觀察到FGFBP2低表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。然而，F(xiàn)GFBP2與食管癌之間的關(guān)系及其作用仍不清楚。

本研究中，我們采用組織微陣列聯(lián)合RNA原位雜交技術(shù)檢測FGFBP2 mRNA在食管癌組織中的表達(dá)，分析了FGFBP2 mRNA表達(dá)與食管癌患者臨床病理參數(shù)和術(shù)后生存時間的相關(guān)性，探討FGFBP2 mRNA表達(dá)是否可以作為食管癌預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。進(jìn)一步通過功能研究，檢測敲降FGFBP2對食管癌細(xì)胞系惡性表型的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本信息

190例食管癌組織和42例配對手術(shù)切緣形態(tài)學(xué)正常的組織(癌旁組織)，取自河南省林州市人民醫(yī)院病理科，上述標(biāo)本來源于190例食管癌患者手術(shù)切除組織，其中71名患者具有完整的預(yù)后信息。本研究中使用的組織均為病理診斷后剩余的標(biāo)本。所有患者術(shù)前均未接受任何治療，并簽署了知情同意書。本研究的設(shè)計和開展獲得了中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(16-084/1163)。

1.2 組織芯片制備

組織標(biāo)本先經(jīng)過福爾馬林固定，石蠟包埋。然后切成厚度為4 μm的切片進(jìn)行蘇木精和伊紅(HE)染色，顯微鏡下閱片，選取相應(yīng)的組織蠟塊標(biāo)記。每個病例選取3個腫瘤組織點(diǎn)和2個正常組織點(diǎn)。將標(biāo)記好的供體蠟塊組織移入受體蠟塊，切成厚度為(5±1)μm的組織微陣列。

1.3 RNA原位雜交及評分標(biāo)準(zhǔn)

FGFBP2的RNAscope探針購自Advanced Cell Diagnostics公司(ACD，Newark，LA)。相關(guān)程序參照說明書進(jìn)行。組織芯片經(jīng)過二甲苯脫蠟和梯度乙醇洗滌兩次后，雙氧水處理10 min，靶標(biāo)修復(fù)液修復(fù)15 min；進(jìn)行RNAscope探針雜交及放大處理，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片后用NanoZoomer數(shù)字病理切片掃描儀(日本濱松)掃描。

評分采取雙盲原則。FGFBP2 mRNA表達(dá)水平根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比確定。染色強(qiáng)度分為0(陰性)、1(弱陽性)、2(中度陽性)、3(強(qiáng)陽性)。陽性細(xì)胞比例分為 0(0)、1(1%~20%)、2(21%~50%)、3(51%~100%)。腫瘤細(xì)胞染色強(qiáng)度×陽性細(xì)胞百分比的平均得分代表標(biāo)本的最終得分?！?分被認(rèn)為是陽性。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

人體食管癌細(xì)胞系KYSE30、KYSE70、KYSE140、KYSE150、KYSE450和KYSE510由日本京都大學(xué)的Shimada Y教授惠贈。細(xì)胞培養(yǎng)條件參考本實驗室前期發(fā)表論文[13]。

1.5 小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染

FGFBP2 siRNA由上海GenPharma公司合成，其序列為：敲降靶點(diǎn)1(5′-CCTGACAGACAACCATCTCTT-3′)、敲降靶點(diǎn) 2(5′-GAACATTGTTGGAAACCCTTC-3′)和陰性對照 siRNA(5′-TTCTCCGAACGUGUCACGT TT-3′)。 使 用 Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉(zhuǎn) 染 48 h，采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.6 RNA提取、cDNA合成和實時定量PCR

使用RNApure組織和細(xì)胞總RNA提取試劑盒(康為世紀(jì))提取細(xì)胞中總RNA。使用HiFi Script cDNA合成試劑盒(康為世紀(jì))進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。qPCR操作步驟如文獻(xiàn)[13]所述。引物序列：FGFBP2，5′-AGAGATTCCT GCACTATGCGT-3′(正向)，5′-ACACCAGTAGGTCTG GTCTGT-3′(反向)；內(nèi)參 GAPDH，5′-TAGGCGCTCA CTGTTCTCT-3′(正 向)，5′-GTTAAAAGCAGCCCTGG TGAC-3′(反向)。

1.7 細(xì)胞增殖檢測

在KYSE150和KYSE510中轉(zhuǎn)染FGFBP2 siRNA培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞并進(jìn)行計數(shù)，取1 000個細(xì)胞接種于含有100 μL RPMI-1640培養(yǎng)基的96孔板中，每組設(shè)置3個平行孔，于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天取出一塊96孔板進(jìn)行檢測。CCK-8(日本同仁化學(xué))用RPMI-1640按1∶10比例稀釋，每孔加入100 μL的CCK-8稀釋液，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。用酶標(biāo)儀(BioTek)在450 nm處測量細(xì)胞的吸光度值，以不同處理組的吸光度值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.8 Western blot

轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取總蛋白。加入5×上樣緩沖液，100℃煮沸10 min。采用Pierce BCA蛋白檢測試劑盒(Thermo)測定蛋白濃度。20 μg蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳和PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗孵育過夜，二抗孵育1 h。采用超增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(普利萊)檢測發(fā)光信號。

實驗過程中所用的AKT、p-AKT、ERK、p-ERK和E-cadherin一抗購自Cell Signaling Technology公司，均以1∶1 000比例稀釋。GAPDH(Cell Signaling Technology)以1∶5 000比例稀釋作為內(nèi)參。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。使用χ2檢驗分析FGFBP2 mRNA在食管癌組織和正常組織中的表達(dá)差異。采用Kruskal-Wallis或Mann-WhitneyU方法分析FGFBP2 mRNA表達(dá)與臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性。繪制Kaplan-Meier生存曲線，確定FGFBP2 mRNA表達(dá)與食管癌患者總生存時間的關(guān)系。單因素及多因素Cox回歸分析不同因素對患者生存的影響。生存分析針對的是總生存時間，指的是患者從手術(shù)之日起到因食管癌死亡的時間或最后一次隨訪確定患者己死亡的時間。如到隨訪截止終點(diǎn)患者仍存活，則此隨訪數(shù)據(jù)截止。采用t檢驗對細(xì)胞增殖、侵襲和遷移數(shù)據(jù)進(jìn)行組間差異比較。以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 FGFBP2 mRNA在食管癌患者癌組織中的表達(dá)

我們對190例食管癌組織和42例癌旁組織進(jìn)行mRNA原位雜交檢測，結(jié)果顯示食管癌組織中FGFBP2 mRNA的表達(dá)陽性率為25.8%(49/190)，而在癌旁組織中不表達(dá)(圖1)。FGFBP2 mRNA的表達(dá)水平在腫瘤組織和癌旁正常組織中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 食管癌組織和癌旁正常組織中FGFBP2 mRNA的表達(dá)情況

2.2 FGFBP2 mRNA表達(dá)情況與食管癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

我們分析了FGFBP2 mRNA的表達(dá)與食管癌患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系(表2)。結(jié)果顯示，F(xiàn)GFBP2mRNA陽性表達(dá)與性別、年齡、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度和病理分期等指標(biāo)均無顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。

表2 FGFBP2 mRNA表達(dá)與食管癌患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.3 FGFBP2 mRNA表達(dá)與食管癌患者預(yù)后的關(guān)系

對具有隨訪資料的病例進(jìn)行Kaplan-Meier分析，結(jié)果顯示FGFBP2 mRNA表達(dá)影響食管癌患者術(shù)后生存時間，且FGFBP2 mRNA表達(dá)陽性患者的總生存時間明顯短于mRNA表達(dá)陰性的患者(P=0.002，圖2)。

圖2 食管癌患者FGFBP2 mRNA表達(dá)的Kaplan-Meier生存分析圖

我們對食管癌患者臨床病理指標(biāo)和FGFBP2 mRNA表達(dá)進(jìn)行了Cox單因素回歸分析，進(jìn)一步選取淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FGFBP2 mRNA表達(dá)進(jìn)行了多因素回歸分析，結(jié)果顯示FGFBP2 mRNA表達(dá)可作為食管癌患者的一個獨(dú)立預(yù)后影響因素，危險度為2.291，95%置信區(qū)間為1.271~4.129(P=0.006)，見表3。

表3 Cox回歸分析

2.4 敲降FGFBP2抑制食管癌細(xì)胞的增殖

利用qPCR技術(shù)檢測6株食管癌細(xì)胞系中FGFBP2的表達(dá)，結(jié)果顯示KYSE150和KYSE510中FGFBP2 mRNA水平高于其他細(xì)胞系(圖3A)，因此我們選取這兩種細(xì)胞系進(jìn)行敲降實驗。與對照組相比，敲降FGFBP2基因可顯著抑制KYSE150和KYSE510細(xì)胞FGFBP2 mRNA的表達(dá)(圖3B，KYSE150細(xì)胞未給出)和增殖(圖3C和3D)。我們進(jìn)一步檢測了與增殖相關(guān)分子的表達(dá)情況。Western blot結(jié)果顯示，在KYSE150和KYSE510中敲降FGFBP2后，AKT的磷酸化水平降低，而ERK的磷酸化水平未發(fā)生改變(圖4)。

3 討論

圖3 敲降FGFBP2抑制食管癌細(xì)胞的增殖

圖4 敲降FGFBP2后下游分子的變化

腫瘤預(yù)后分子標(biāo)志物的研發(fā)可能為腫瘤患者的治療提供潛在的靶點(diǎn)、療效預(yù)測及評價指標(biāo)。目前已有大量報道采用qPCR技術(shù)獲得食管癌潛在的預(yù)后判斷mRNA標(biāo)志物，例如ANRIL[14]、GOLM1-NAA35[15]等，也有非常少量的研究采用常規(guī)RNA原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)食管癌患者預(yù)后相關(guān)mRNA分子，例如Stathmin[16]、HCCR-1[17]等。然而，由于mRNA容易降解，特別是經(jīng)福爾馬林固定和石蠟包埋組織中的mRNA，導(dǎo)致qPCR和常規(guī)RNA原位雜交對于檢測固定和包埋組織中的mRNA均有明顯的局限性。因此，目前尚無任何一種mRNA標(biāo)志物應(yīng)用于食管癌臨床檢測。

RNAscope原位雜交是近年來發(fā)展的一種用于檢測細(xì)胞以及經(jīng)固定和包埋組織中目標(biāo)RNA分子的原位雜交新技術(shù)，其利用雙“Z”探針(靶RNA識別序列長約18～25個堿基)和信號放大系統(tǒng)，保證信號的特異性和強(qiáng)度，具有較高的靈敏度和較低的背景。特別是，該技術(shù)對于檢測石蠟組織中的RNA分子，可以獲得穩(wěn)定可靠的結(jié)果。由于該技術(shù)通常針對目標(biāo)RNA設(shè)計多對探針(可達(dá)20對)，利用多個短探針覆蓋目標(biāo)RNA較長的片段，可以彌補(bǔ)固定和包埋樣品中部分RNA降解對信號強(qiáng)度造成的影響[18-20]。越來越多的研究利用RNAscope原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)了腫瘤患者預(yù)后相關(guān)mRNA分子[21-24]。因此，該技術(shù)有望成為腫瘤病理診斷、治療和預(yù)后判斷的手段之一。Du等[25]通過對食管癌冰凍組織進(jìn)行Western blot分析，以及對石蠟組織進(jìn)行RNAscope原位雜交分析，驗證了KRT17蛋白和mRNA在食管癌細(xì)胞中均存在高表達(dá)，而在正常上皮細(xì)胞中不表達(dá)，表明RNAscope檢測結(jié)果具有較高的穩(wěn)定性。然而，到目前為止，在食管癌中使用該技術(shù)原位檢測RNA分子的研究很少，且尚無關(guān)于預(yù)后判斷RNA標(biāo)志物的報道。在本研究中，我們對食管癌組織中FGFBP2 mRNA進(jìn)行了RNAscope檢測分析，發(fā)現(xiàn)FGFBP2 mRNA在腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著升高。我們的結(jié)果顯示，F(xiàn)GFBP2 mRNA僅在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常組織、以及腫瘤中的間質(zhì)細(xì)胞中均不表達(dá)，且原位雜交信號反差強(qiáng)；同時，其在預(yù)后較好和預(yù)后較差患者的腫瘤細(xì)胞中的信號反差也較明顯，表明該探針具有較高的特異性。我們發(fā)現(xiàn)FGFBP2 mRNA表達(dá)是食管癌患者的一個獨(dú)立預(yù)后影響因素，提示其有潛力作為食管癌患者預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物，以及為T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度等臨床病理指標(biāo)提供有效補(bǔ)充。

目前尚無關(guān)于FGFBP2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中相關(guān)機(jī)制的研究報道。本研究結(jié)果揭示了FGFBP2在食管癌細(xì)胞中的潛在作用和相關(guān)信號通路的變化，發(fā)現(xiàn)FGFBP2高表達(dá)通過激活A(yù)KT信號通路，進(jìn)而促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖。癌細(xì)胞增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要特征，其受到缺氧誘導(dǎo)因子1、磷酸肌醇3激酶(PI3K)/AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶1(AKT)、胰島素樣生長因子受體1、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、以及雄激素和雌激素受體信號等的調(diào)控[26]，上述信號通路和關(guān)鍵分子可能為惡性腫瘤提供輔助診斷標(biāo)志物和潛在的分子靶點(diǎn)。PI3K/AKT和Ras/MEK/ERK是參與調(diào)控多種細(xì)胞增殖最重要的兩條信號通路[27]?；罨腁KT可通過調(diào)控多個下游關(guān)鍵信號節(jié)點(diǎn)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活、增殖、生長和細(xì)胞代謝通路的改變[28]。

綜上所述，我們的研究結(jié)果表明，利用RNAscope原位雜交技術(shù)檢測的FGFBP2 mRNA表達(dá)有潛力作為食管癌患者的預(yù)后判斷分子標(biāo)志物。同時，本研究揭示了FGFBP2通過AKT信號通路對食管癌細(xì)胞增殖的作用，為進(jìn)一步深入研究食管癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及發(fā)現(xiàn)新靶點(diǎn)提供前期實驗基礎(chǔ)。