李菁菁， 姜 曈， 石 梅

空軍軍醫(yī)大學(xué)附屬第一醫(yī)院 放射治療科，陜西 西安 710032

國際癌癥研究機構(gòu)公布的數(shù)據(jù)顯示，世界上每年約有8.65萬新的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)患者[1]，在東南亞尤其是中國是一種高風(fēng)險的頭頸部腫瘤[2-3]。因NPC解剖位置較深，手術(shù)切除復(fù)雜，且放射敏感性較高，放射治療(radiotherapy，RT)已成為NPC的主要治療方式[4]。隨著RT技術(shù)和設(shè)備的不斷提升，NPC患者存活率有所提高，但由于腫瘤的輻射抗性，部分NPC患者在治療后2年內(nèi)會出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[5-6]。正常器官和組織中的成體干細(xì)胞通過自我更新，長期為最終分化的器官和組織提供細(xì)胞，使器官和組織維持其功能[7]。研究表明，許多癌癥都是由具有干細(xì)胞特性的少量腫瘤細(xì)胞驅(qū)動，即腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)[8]。電離輻射(ionizing radiation，IR)可引起腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)的多種變化[9]，可能促進(jìn)放射抵抗、腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,以及其他的惡性表型。同時，炎癥細(xì)胞刺激產(chǎn)生的細(xì)胞因子可啟動CSCs的擴增，導(dǎo)致環(huán)境誘變和氧化損傷靶向的細(xì)胞池擴大，并在消除腫瘤后又重建腫瘤[10]。非甾體抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drug，NSAIDs)可通過不同的機制抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展[11]。環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)可誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生，促進(jìn)腫瘤生長和進(jìn)展，并與較高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險、較差的存活率密切相關(guān)[12]。塞來昔布作為NSAIDs，是COX-2的特異性抑制劑，被認(rèn)為具有多種潛在的抗腫瘤機制，可經(jīng)過多重途徑在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[13]。本研究通過2 Gy60鈷(60Co) γ射線連續(xù)照射NPC的CNE-1細(xì)胞獲得殘癌細(xì)胞，并給予塞來昔布處理，探討其對殘癌細(xì)胞的干細(xì)胞表型標(biāo)志物表達(dá)的影響，為NPC精準(zhǔn)靶向治療提供研究思路?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人NPC的CNE-1細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自杭州四季青；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)、RIPA裂解液(強)、Tween?20購自北京索萊寶；八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(octamer-binding transcription factor 4,OCT4)引物、性別決定區(qū)Y框蛋白2 (SRY related HMG box-2,SOX2)引物、Kruppel樣因子4(Kruppel-like factor 4,KLF4)引物、β-actin引物由北京奧科合成；總RNA提取試劑盒、FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal熒光定量預(yù)混試劑購自北京天根；塞來昔布購自美國Selleck；二甲基亞砜購自美國Sigma；CCK8試劑盒購自廣州沛瑜；BCA蛋白定量試劑盒、蛋白預(yù)染marker購自美國Thermo；5倍Loading Buffer購自西安赫特；蛋白凝膠試劑盒購自武漢博士德；脫脂奶粉購自美國Difco；兔單克隆抗體OCT4、KLF4、SOX2購自美國Abcam；鼠單抗β-Actin購自美國CST；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自美國Pioneer；ECL化學(xué)發(fā)光液購自美國Milipore。

1.2 儀器與耗材 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、NanoDrop 2000購自美國Thermo；低溫高速離心機購自德國Heraeus；臺式常溫離心機購自長沙湘儀；實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀購自Bioneer；倒置光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus；凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad；細(xì)胞培養(yǎng)板及培養(yǎng)瓶購自美國Eppendorf；PVDF膜購自美國Millipore。輻射源為60Co，由空軍軍醫(yī)大學(xué)輻照中心提供。

1.3 研究方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) CNE-1細(xì)胞在含10% FBS的1640培養(yǎng)液中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)條件為5% CO2、37℃。

1.3.260Co γ射線照射 在25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接種已進(jìn)入對數(shù)生長期的CNE-1細(xì)胞，待細(xì)胞生長融合至40%～50%瓶底面積時，模擬臨床腫瘤RT的分割療法，單次照射劑量為2 Gy，劑量率1 Gy/min，連續(xù)隔日照射。連續(xù)7次照射CNE-1細(xì)胞獲得殘癌細(xì)胞株E-R7。

1.3.3 CCK-8實驗 將接種的細(xì)胞按等比稀釋成一個細(xì)胞濃度梯度，每組4～6個復(fù)孔。接種后，培養(yǎng)2～4 h使細(xì)胞貼壁，然后每100 μl培養(yǎng)基加10 μl的CCK-8試劑培養(yǎng)后測定光密度(optical density，OD)值，制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定出樣品的細(xì)胞數(shù)量。在96孔板中接種細(xì)胞懸液100 μl/孔，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h；向每孔加入10 μl的CCK-8溶液，注意不要產(chǎn)生氣泡；將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h；用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度；在96孔板中接種細(xì)胞懸液100 μl/孔，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h；向培養(yǎng)板加入不同濃度的塞來昔布；將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育適當(dāng)?shù)臅r間，向每孔加入10 μl的CCK8溶液；將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h；用酶標(biāo)儀測定在450 nm 處的吸光度。

細(xì)胞存活率=[(實驗孔吸光度-空白孔吸光度)/ (對照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100%

1.3.4 實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PBS清洗細(xì)胞2次，使用總RNA提取試劑盒，按照天根DP419說明書提取總RNA。使用NanoDrop 2000在260 nm和280 nm處檢測提取的RNA樣品純度及濃度。使用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒，按照天根KR116說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用SuperReal熒光定量預(yù)混試劑，按照天根FP205說明書進(jìn)行實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。引物序列：OCT4上游(5，-GTGGAGAGCAACTCCGATG-3，)，下游(5，-TGCTCCAGCTTCTCCTTCTC-3，)；KLF4上游(5，-CCGCTCCATTACCAAGAGCT-3，)，下游(5，-ATCGTCTTCCCCTCTTTGGC-3，)；SOX2上游(5，-CGAGTGGAAACTTTTGTCGGA-3，)，下游(5，-TGTGCAGCGCTCGCAG-3，)；β-actin上游(5，-CCTGGGCATGGAGTCCTGTG-3，)，下游(5，-TCTTCATTGTGCTGGGTGCC-3，)。以β-actin snRNA為實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測OCT4、KLF4和SOX2表達(dá)的內(nèi)參，通過2-ΔΔCT法計算各組細(xì)胞間表達(dá)差異。

1.3.5 免疫印跡 將細(xì)胞接種于25 m2培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞融合至80%～90%時，吸棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞3次，培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶置于冰上，加入強RIPA裂解液，冰上裂解30 min。細(xì)胞刮刷刮取并收集細(xì)胞，4℃ 12 000 g離心15 min，吸取部分上清，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，剩余上清加入1/4體積的5倍Loading Buffer，金屬浴100℃加熱5 min；配制10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，20 μg蛋白樣本/泳道，恒壓電泳，上層膠電壓80 V，下層膠電壓120 V；恒流轉(zhuǎn)膜，電流200 mA濕轉(zhuǎn)120 min；用含5%脫脂奶粉的TBST，室溫封閉PVDF膜1 h，封閉后洗膜3次，每次5 min。TBST稀釋一抗OCT4(1∶1 000)、KLF4(1∶1 000)、SOX2(1∶1 000)、β-Actin(1∶1 000)，孵育4℃過夜。次日清洗PVDF膜3次，5 min/次。TBST稀釋二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶1 000)、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)，室溫孵育2 h 。孵育后用TBST清洗PVDF膜3次，5 min/次。膜上滴加適量化學(xué)發(fā)光液，利用凝膠成像系統(tǒng)曝光成像。以β-Actin為內(nèi)參，通過Image J軟件計算條帶的灰度值，比較細(xì)胞間OCT4、KLF4和SOX2表達(dá)水平差異。

2 結(jié)果

2.1 塞來昔布藥物濃度篩選 E-R7細(xì)胞進(jìn)行CCK-8實驗，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。當(dāng)吸光值為1時，得出最佳種植細(xì)胞數(shù)為2.2×104個/孔。按照最佳細(xì)胞數(shù)將E-R7細(xì)胞種植入96孔板中，進(jìn)行CCK-8實驗。根據(jù)公式計算細(xì)胞存活率，并繪制曲線圖，見圖2。當(dāng)存活率為50%時，塞來昔布半抑制濃度為131 μM。

2.2 E-R7細(xì)胞干細(xì)胞表型標(biāo)志物表達(dá)情況 按照塞來昔布半抑制濃度，給予E-R7細(xì)胞塞來昔布處理。實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測定結(jié)果顯示，塞來昔布處理后，E-R7細(xì)胞中干細(xì)胞表型標(biāo)志物SOX2、OCT4、KLF4的mRNA表達(dá)水平較未處理的E-R7細(xì)胞明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。免疫印跡檢測結(jié)果顯示，塞來昔布處理后，E-R7細(xì)胞中干細(xì)胞表型標(biāo)志物SOX2、OCT4、KLF4的蛋白表達(dá)水平較未處理的E-R7細(xì)胞明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2、圖3。

圖1 E-R7細(xì)胞CCK-8實驗標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 E-R7細(xì)胞CCK-8存活-濃度曲線

細(xì)胞SOX2OCT4KLF4未處理E-R7111塞來昔布處理后E-R70.585±0.0160.632±0.0220.696±0.017t值50.87372.74862.643P值<0.05<0.05<0.05

表2 E-R7細(xì)胞干細(xì)胞表型標(biāo)志物蛋白相對表達(dá)量

圖3 E-R7細(xì)胞干細(xì)胞表型標(biāo)志物蛋白表達(dá)

3 討論

癌癥包含不同種類的基質(zhì)細(xì)胞群，支持癌細(xì)胞群基因?qū)用娴姆只?，由已分化的?xì)胞和少數(shù)CSCs組成，具有自我更新的干細(xì)胞特性，能夠重新填充整個腫瘤，維持腫瘤增殖，促進(jìn)癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[14-15]。鑒于CSCs的功能特點，治療后存活的CSCs可能導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。研究表明，CSCs的數(shù)量與對輻射的反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)，表明CSCs是腫瘤輻射抵抗和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵[16]。此外，非CSCs對CSCs性質(zhì)的重新獲得以及對TME變化的適應(yīng)性反應(yīng)影響CSCs介導(dǎo)的外源性輻射抗性[17-18]。因此，RT需要通過靶向CSCs藥物進(jìn)行生物改良，以提高放射反應(yīng)并防止長期復(fù)發(fā)。CSCs既可直接被干細(xì)胞表型標(biāo)志物的特異性抗體靶向，也可通過靶向其功能的機制來抑制輻射抗性，以上策略可提高患者RT后的存活率。

目前，在干性表型的核心調(diào)控因子中，SOX2被認(rèn)為是核心多功能相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)鍵分子之一，在胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新和干性的維持中起到積極作用，且參與體細(xì)胞重新編程成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的過程[19-21]。有研究證實，SOX2在癌癥中具有致癌作用，其高表達(dá)是多個CSCs樣表型的關(guān)鍵，已在多種預(yù)后較差的癌癥中被發(fā)現(xiàn)[22-24]。SOX2陽性的腫瘤細(xì)胞作為腫瘤生長的起始群體，具有啟動和增殖腫瘤生長的能力，并在不同的腫瘤類型中產(chǎn)生分化細(xì)胞的多樣性，從而促進(jìn)腫瘤的惡性發(fā)展。因此，抑制SOX2可能是一種新的、更有效的減少NPC在RT后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的輔助治療方式。

COX-2在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用[25]。塞來昔布作為一種選擇性COX-2抑制劑，被認(rèn)為具有多種潛在的抗腫瘤機制，包括抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)TME、抗血管生成作用等。塞來昔布與莪術(shù)酚聯(lián)合應(yīng)用，在體內(nèi)外均可明顯降低非小細(xì)胞肺癌的生長和凋亡[26]。研究報道，包括塞來昔布在內(nèi)的聯(lián)合用藥可顯著提高治療的總體反應(yīng)率[27]；在晚期非小細(xì)胞肺癌的化療中加入塞來昔布可提高總體反應(yīng)率[28]。塞來昔布聯(lián)合化療提高COX-2陽性胃癌患者的總體存活率、無病存活率和生活質(zhì)量，但未增加不良事件的風(fēng)險[29]。

本研究中，通過CCK-8實驗，測定塞來昔布對CNE-1殘癌細(xì)胞半抑制濃度為131 μM。實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、免疫印跡結(jié)果顯示，塞來昔布可降低NPC殘癌的干細(xì)胞表型標(biāo)志物OCT4、KLF4和SOX2的表達(dá)。說明塞來昔布不僅與降低癌癥發(fā)病率有關(guān)，而且與改善癌癥患者的預(yù)后有關(guān)。然而，塞來昔布作為癌癥患者新輔助治療的有效性數(shù)據(jù)還不充分，對塞來昔布產(chǎn)生更好結(jié)果的因素仍有待進(jìn)一步研究。此外，鑒于癌癥患者對塞來昔布反應(yīng)的潛在差異，確定其使用目標(biāo)人群至關(guān)重要。

綜上所述，塞來昔布可抑制經(jīng)2 Gy60Co γ射線連續(xù)照射的CNE-1細(xì)胞獲得的殘癌細(xì)胞干細(xì)胞表型標(biāo)志物SOX2、OCT4、KLF4的表達(dá)。