陳 銘 吳 帥 黃軼群 牛麗紅 樊玉霞,4 賴克強(qiáng),4

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410114；3.魯東大學(xué)食品與工程學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264035；4.上海海洋大學(xué)食品熱加工工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

食源性晚期糖化終末產(chǎn)物(Advanced glycation end-products，AGEs)是在非酶促反應(yīng)條件下，主要通過葡萄糖、果糖等還原糖的羰基和蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸或核酸的氨基，經(jīng)過一系列復(fù)雜的反應(yīng)而產(chǎn)生的一組化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的化合物[1-2]，如羧甲基賴氨酸(Nε-carboxymethyllysine,CML)、羧乙基賴氨酸(Nε-carboxyethyllysine，CEL)和吡咯素等。食源性AGEs在人體內(nèi)的積累，與人體的衰老和一些慢性疾病的發(fā)生(如阿爾茨海默病、慢性腎病、高血壓等)有關(guān)[3-4]。因此，膳食中的AGEs含量、形成與控制成為近10年來(lái)食品安全領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

肉類食品中富含蛋白質(zhì)和脂肪，有利于AGEs的形成，加之肉類食品往往經(jīng)較高溫度或長(zhǎng)時(shí)間煮制，極大地促進(jìn)AGEs的產(chǎn)生[5-6]，故而肉類食品中的AGEs含量通常很高，具有潛在的安全隱患。目前，肉類食品AGEs相關(guān)的研究較為缺乏，基本還停留在收集數(shù)據(jù)階段，主要集中在不同的加工方式(蒸煮、油炸、輻照、烘焙等)及原料組分(包括肉的種類、脂肪和蛋白質(zhì)含量、醬料、亞硝酸鹽和食鹽等添加劑)對(duì)AGEs含量的影響[6-8]，近年來(lái)，儲(chǔ)藏過程對(duì)肉品中AGEs含量及其后續(xù)熱加工過程中AGEs形成的影響也有報(bào)道[8-9]。

香辛料(如八角、香葉、白芷、山奈等)常用于肉品的烹飪及加工中，以賦予其一些特有的風(fēng)味。有關(guān)香辛料的揮發(fā)性成分以及香辛料的抗氧化作用方面的研究報(bào)道很多，此外，檸檬草、姜黃、咖喱姜、八角、小茴香等香辛料被用來(lái)降低牛肉及其制品中雜環(huán)胺的含量[10-11]以及豬肉中丙烯酰胺的含量[12]。近幾年來(lái)，有研究表明，香辛料可以抑制蛋白質(zhì)的糖化作用，例如，Cazzola等[13]在牛乳清蛋白—葡萄糖模擬體系中加入鼠尾草、辣椒、洋蔥、大蒜、迷迭香等，可以抑制30%～75%蛋白質(zhì)糖化作用；Ramkissoon等[14]在同樣的模擬體系中加入百里香、歐芹及其他混合香辛料，可以抑制10%～40% AGEs含量；Hafsa等[15]采用莫邪菊的醇溶性提取物，最高可減少牛乳清蛋白—葡萄糖體系中77.8%的AGEs形成。但是，這些香辛料對(duì)AGEs的影響的研究都是采用簡(jiǎn)單的模擬體系，而且都是采用熒光分光光度法分析添加香辛料的樣品與空白對(duì)照樣品的某一特征波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度的相對(duì)變化，并未分析具體的AGEs含量。經(jīng)檢索，迄今尚未見常用香辛料對(duì)肉品中AGEs含量的影響的研究報(bào)道。

本研究擬以豬肉為對(duì)象，采用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS/MS)結(jié)合CML和CEL的同位素內(nèi)標(biāo)物作為AGEs的分析方法，研究山奈、白芷和香葉3種肉品加工中常用食用香料的添加，對(duì)豬肉在加熱過程中AGEs形成的影響，為最終減低肉制品中AGEs的含量提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬肉：里脊肉，上海市浦東新區(qū)惠南鎮(zhèn)愛森優(yōu)選店；

香料：香葉、白芷、山奈，購(gòu)于上海市麥德龍(上海浦東龍陽(yáng)路店)；

濃鹽酸、氫氧化鈉、氨水、氯仿、硼氫化鈉、硼酸、硼砂：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

甲醇、甲酸、乙酸銨：色譜純，百靈威公司；

AGEs標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)物：d4-CML、d4-CML、CML、CEL(純度均為98%)，加拿大Toronto Research Chemicals公司。

李曉英眼淚橫流。倏地，她的右手掌，猛地托住陳山利的后腦，左手?jǐn)r腰擁住他，將整個(gè)身體貼近他，她漆黑的眼瞳，溫柔地望向他。他的后頸，被穿過發(fā)絲的手按住，唇瓣間傳來(lái)濕潤(rùn)的觸感，被她輕輕含住，緩緩親吻……

高速組織搗碎機(jī)：HGBTWTS3型，美國(guó) Waring Commercial 公司；

真空干燥箱：DZF-6050型，上海精宏真空設(shè)備有限公司；

手持式均質(zhì)機(jī)：T10型，德國(guó) IKA 公司；

數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：GZX-9146 MBE型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

離心機(jī)：TDL-5-A型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

陽(yáng)離子交換固相萃取小柱：CNWMCX混合型(60 mg/3 mL)，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

氮吹儀：DC-12型，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

超高效液相色譜儀：A-30型，美國(guó) PerkinElmer公司；

三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀：Qtrap 4500型，美國(guó)SCIEX質(zhì)譜系統(tǒng)公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 配制標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)的母液CML(100 mg/L)、d4-CML(100 mg/L)、CEL(200 mg/L)、d4-CEL(200 mg/L)，放置于4 ℃冰箱保存。將上述CML和CEL母液混合配制成4 mg/L標(biāo)準(zhǔn)液，d4-CML和d4-CEL混合配制成含4 mg/L混合內(nèi)標(biāo)液(d4-CML-CEL)，并放置在-20 ℃冰箱貯藏。

1.2.2 豬肉的加熱處理 去除豬肉里脊表面可見的筋膜，將其切成大約1×1×1 cm3的小方塊，按豬肉重量添加1%的白芷、山奈或香葉，用攪拌機(jī)混勻。隨后稱取約13 g的肉糜置于金屬鋁盒(內(nèi)徑50 mm；內(nèi)高5 mm)中，在100 ℃油浴鍋中加熱5，10，20，40，120 min后，取出，在冰水混合物中冷卻30 min，收集豬肉樣及其汁水于研缽中研磨均勻，放置于自封袋中冰藏，并在60 min內(nèi)用于AGEs提取。采用不同批次的豬肉重復(fù)試驗(yàn)2次。

1.2.3 豬肉中結(jié)合態(tài)CML和CEL的提取 豬肉中結(jié)合態(tài)AGEs含量的提取方法參照 Assar 等[16]、Niquet-Léridon 等[17]和Niu等[8]的提取方法，具體的提取過程如下：稱取約0.2 g的肉樣，加入2 mL硼酸鈉緩沖液(0.2 mol/L，pH 9.2)和0.4 mL硼氫化鈉溶液，混合后置于0 ℃冰箱中過夜還原12 h；加入4 mL氯仿—甲醇(體積比2∶1)，震蕩混勻，在5 000 r/min條件下離心10 min，去除脂肪并沉淀蛋白質(zhì)；去除液態(tài)層，向沉淀的蛋白質(zhì)中加入4 mL鹽酸(6 mol/L)，然后在110 ℃溫度下酸解24 h；將水解液稀釋至10 mL容量瓶中，移取2 mL，加入0.2 mL混合內(nèi)標(biāo)液d4-CML-CEL (4 mg/L)后，進(jìn)行真空干燥；用4 mL超純水重新溶解，并震蕩混勻，后經(jīng)SPE固相萃取凈化，將最終洗脫液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊?，溶解? mL甲醇—水(體積比80∶20)溶液中，再經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

1.2.4 基于UPLC-MS/MS分析樣品中的CML和CEL含量 采用PerkinElmer Altus A-30 UPLC色譜儀和 Qtrap 4500三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀在正電噴霧電離模式下，對(duì)提取液中AGEs含量進(jìn)行分析。儀器測(cè)定條件參照牛麗紅[18]的方法，其中，質(zhì)譜檢測(cè)的定性定量條件如表1所示，分別采用m/z209→88和m/z223→88作為d4-CML和d4-CEL的定量子離子，m/z205→130和m/z219→130作為CML和CEL的定量離子。標(biāo)準(zhǔn)曲線中 CML、CEL的濃度范圍各為20～800 ng/mL。

1.2.5 蛋白質(zhì)、脂肪、水分的測(cè)定 按2007年AOAC標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，分別采用凱氏定氮法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)含量(AOAC 928.08-2007)、索氏提取法測(cè)定脂肪含量(AOAC 991.36-2007)以及烘箱干燥法測(cè)定水分含量(AOAC 950.46-2007)。每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

除非特別說(shuō)明，豬肉中AGEs、蛋白質(zhì)等含量按肉樣的重量計(jì)算。

采用Microsoft Excel 2013對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用以下動(dòng)力學(xué)反應(yīng)方程式對(duì)CML和CEL的形成速率及反應(yīng)級(jí)數(shù)進(jìn)行擬合或計(jì)算：

(1)

表1在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下檢測(cè)CML、CEL、d4-CML和d4-CEL所用的質(zhì)譜參數(shù)
Table 1 Mass parameters in multiple reaction monitoring mode for CML,CEL,d4-CML and d4-CEL

分析物母離子(m/z)子離子(m/z)去簇電壓(DP)/V碰撞能(CE)/VCML2051306615846625CEL2191306517846525d4-CML2091346815886825d4-CEL2231347317887325

式中：

k——反應(yīng)速率常數(shù)，mg/(kg·min)；

t——反應(yīng)時(shí)間，min；

c——CML或CEL的在時(shí)間t時(shí)的濃度，mg/kg；

n——反應(yīng)級(jí)數(shù)(本試驗(yàn)驗(yàn)證反應(yīng)級(jí)數(shù)為0，1，2)。

依照化學(xué)方程式(1)所示，分別以c(n=0)，lnc(n=1)，1/c(n=2)為y軸，時(shí)間t為x軸作圖，根據(jù)其線性的相關(guān)系數(shù)R2的大小確定反應(yīng)級(jí)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 加熱對(duì)豬肉中AGEs含量的影響

試驗(yàn)中所用豬肉樣品的水分、蛋白質(zhì)和脂肪的百分比含量分別為(73.63±0.78)%～(75.38±1.07)%、(22.10±0.78)%～(24.10±0.94)%和(0.52±0.04)%～(3.47±0.29)%。

表2為兩不同批次的新鮮豬肉及其在100 ℃下加熱后CML和CEL的含量，新鮮豬肉中CML含量為(6.79±0.13)～(7.32±0.46)mg/kg，CEL含量為(2.21±0.12)～(2.80±0.26)mg/kg，與其他研究的結(jié)果相似[19-20]，隨著加熱時(shí)間的增加，CML和CEL的含量也逐漸增加，尤其是經(jīng)120 min加熱后，豬肉中CML的含量高達(dá)(35.60±2.20)～(40.68±5.66)mg/kg，CEL達(dá)(13.32±1.49)～(16.85±2.44)mg/kg，比生肉的AGEs含量增加約5～8倍，表明長(zhǎng)時(shí)間加熱對(duì)豬肉中AGEs的含量影響很大，遠(yuǎn)高于已報(bào)道的一些經(jīng)油炸或高溫炙烤的高AGEs含量的肉類食品，如在160 ℃下加熱72 min的豬肉中，CML含量為26 mg/100 g·蛋白質(zhì)[19]；在140 ℃ 下油炸4 min的豬肉中，CML含量為105 mg/kg·蛋白質(zhì)[21]；在204 ℃下油炸20 min的牛肉和豬肉中，CML含量分別為20.03，17.53 mg/kg[22]。高溫條件下，豬肉中的美拉德反應(yīng)、蛋白質(zhì)和脂肪氧化反應(yīng)加速，促進(jìn)AGEs或其活前體物的形成，從而增加AGEs的含量[19-22]。

表2 生肉及加熱處理(100 ℃,5～120 min)后豬肉中的羧甲基賴氨酸(CML)和羧乙基賴氨酸(CEL)含量Table 2 The amounts of Nε-carboxymethyllysine (CML)and Nε-carboxyethyllysine (CEL)in raw and heat treated (100 ℃,5～120 min)pork (n=3)

因生肉本身含有AGEs，加熱后豬肉中CML或CEL含量減去生肉中CML或CEL的含量，即為加熱過程中豬肉的CML和CEL的生成量，圖1為兩批豬肉加熱過程中CML和CEL的形成量，在加熱的前40 min，豬肉中CML和CEL的形成速度快，在40～120 min時(shí)，CML和CEL生成速度減慢。豬肉中CML和CEL的形成量與加熱時(shí)間(0～40 min)的關(guān)系基本符合零級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程(R2=0.942～0.981)(表3)，意味著CML和CEL的濃度對(duì)其生成速率無(wú)影響，食品中美拉德的反應(yīng)產(chǎn)物的形成速率大多數(shù)都屬于零級(jí)反應(yīng)，是由于生成物濃度通常遠(yuǎn)低于反應(yīng)物的濃度[20]。在0～40 min時(shí)間內(nèi)，CML的反應(yīng)速率為0.41～0.56 mg/(kg·min)，CEL的反應(yīng)速度為0.15～0.27 mg/(kg·min)，表明CML和CEL在不同的反應(yīng)時(shí)間里的生成速率是不同的，可能是由于CML和CEL的形成途徑不盡相同，如其對(duì)應(yīng)的前體物質(zhì)乙二醛和甲基乙二醛的生成速率不同，進(jìn)而導(dǎo)致CML和CEL的生成速率不同。Sun等[20]發(fā)現(xiàn)牛肉在加熱過程(在100 ℃，0～60 min)中也存在相似的規(guī)律：其AGEs的形成為零級(jí)反應(yīng)(R2=0.902～0.907)，CML的生成速率[0.23 mg/(kg·min)]高于CEL為的生成速率[0.12 mg/(kg·min)]。

圖1 豬肉加熱過程中(100 ℃，5～120 min)羧甲基賴氨酸 (CML)和羧乙基賴氨酸(CEL)的形成量Figure 1 The amount of Nε-carboxymethyllysine (CML)and Nε-carboxyethyllysine (CEL)in pork formed during heating (100 ℃,5～120 min)

表3不同動(dòng)力學(xué)模型下(n=0，1，2)豬肉中羧甲基賴氨酸 (CML)和羧乙基賴氨酸(CEL)含量變化與加熱時(shí)間(100℃，0～40 min)的線性相關(guān)系數(shù)(R2)
Table 3 Correlation of determination(R2)for kinetic models(n=0,1 or 2)of the formation ofNε-carboxymethyllysine(CML)andNε-carboxyethyllysine(CEL)during heating(100℃,0～40 min)

肉的批次CML012CEL012第一批次0.9710.9730.8840.9780.9910.891第二批次0.9810.9440.8780.9420.8620.762

2.2 香料對(duì)豬肉加熱過程中AGEs含量的影響

表4為2個(gè)批次的豬肉分別加入山奈、白芷、香葉在100 ℃條件下加熱后結(jié)合態(tài)CML和CEL的含量，從中可知：與未加香料的豬肉相類似，加熱時(shí)間越長(zhǎng)，加入香料處理的肉中CML和CEL的含量越高，加熱的前40 min，CML和CEL的增長(zhǎng)速度較快，40～120 min時(shí)CML和CEL增長(zhǎng)速度較緩慢；加入香料的兩批肉樣，加熱不同時(shí)間后產(chǎn)生的CEL均比對(duì)應(yīng)的未加香料的高，尤其是5 min加熱處理的樣品，其CEL含量平均增加42%(山奈，兩批肉樣分別為61%和24%)、30%(白芷，兩批肉樣分別為49%和13%)和34%(香葉，兩批肉樣分別為49%和20%)，不過，加熱120 min的樣品，加入香料的肉樣與未加香料的肉樣相比其CEL差別較小，平均增加8～12%；香料對(duì)加熱過程中CML的形成總體來(lái)說(shuō)影響較小，而且因香料的種類、加熱時(shí)間、肉的批次的不同而不同，盡管經(jīng)120 min加熱處理后，加入香料的肉樣的CML平均增加15%(山奈，兩批肉樣分別為20%和9%)、23%(白芷，兩批肉樣分別為37%和8%)和20%(香葉，兩批肉樣分別為19%和22%)，在其他的加熱條件下，如加入白芷和香葉加熱40 min的肉樣，香料的加入可能對(duì)CML的形成有一定的抑制作用；對(duì)于CML和CEL的總量來(lái)說(shuō)，山奈的加入，使得豬肉在加熱過程中(5～120 min)的AGEs含量增加6%～30%，而肉中添加白芷和香葉除了在120 min 加熱條件下，使得AGEs總量分別增加19%(白芷，兩批分別為27%和10%)和18%(香葉，兩批肉樣分別為15%和22%)外，在其他的加熱條件下對(duì)加熱過程中AGEs總量的產(chǎn)生的影響趨勢(shì)不明確。

表4 生肉及含山奈、白芷、香葉的豬肉加熱處理(100 ℃,5～120 min)后羧甲基賴氨酸(CML)和羧乙基賴氨酸(CEL)含量Table 4 The amounts of Nε-carboxymethyllysine (CML)and Nε-carboxyethyllysine (CEL)in raw and heat treated (100 ℃,5～120 min)pork added with galangal,angelica root or bay leaves (n=3)

山奈、白芷、香葉中存在一定數(shù)量的酚類、黃酮類物質(zhì)，具有抗氧化性[23-25]，另外，一些研究[13-15]表明，富含天然抗氧化劑的香辛料對(duì)蛋白質(zhì)糖化反應(yīng)有顯著的抑制作用，而且，Kim等[26]還發(fā)現(xiàn)從白芷中提取的異歐前胡素能夠有效地減少牛血清蛋白—葡萄糖果糖體系中16.3% 的吡咯酮含量。但是，本研究在豬肉中直接添加山奈、白芷或香葉粉，對(duì)加熱過程中CML和CEL的產(chǎn)生不但沒有明顯的抑制作用，而是顯示出一定的促進(jìn)作用，因AGEs產(chǎn)生途徑復(fù)雜多樣，且目前缺乏香辛料對(duì)AGEs變化的影響報(bào)道，山奈、白芷、香葉對(duì)豬肉加熱過程中AGEs形成的潛在促進(jìn)作用的機(jī)理有待進(jìn)一步明確。

與未加香料的豬肉類似，加入山奈、白芷或香葉后的豬肉在加熱過程中(0～40 min)，其CML和CEL的形成均為零級(jí)反應(yīng)，CML的和反應(yīng)速率為0.434～0.531 mg/(kg·min)(R2=0.985～0.992)，CEL反應(yīng)速率為0.249～0.288 mg/(kg·min)(R2=0.984～0.989)。另外，如圖2所示，試驗(yàn)中所涉及的所有豬肉樣品中CML與CEL含量有較強(qiáng)的線性相關(guān)性(R2=0.882)。

圖2 豬肉中羧甲基賴氨酸(CML)和羧乙基賴氨酸(CEL)含量的相關(guān)性Figure 2 Relationship between Nε-carboxymethyllysine (CML)and Nε-carboxyethyllysine(CEL)in pork

3 結(jié)論

加熱對(duì)豬肉中結(jié)合態(tài)CML和CEL的形成有促進(jìn)作用，且加熱時(shí)間越長(zhǎng)，其AGEs含量也越大，當(dāng)加熱到120 min 后，CML和CEL的含量約為生肉的5～8倍。加熱時(shí)間為0～40 min時(shí)，不管是否添加香料，CML和CEL的反應(yīng)速率均為零級(jí)反應(yīng)(R2=0.942～0.992)。肉中添加白芷、山奈或香葉，對(duì)加熱過程中AGEs的影響因香料的種類、加熱時(shí)間、肉的批次的不同而不同，總體來(lái)說(shuō)，香料對(duì)加熱過程中豬肉的CML的形成影響較小，但對(duì)CEL的形成有一定的促進(jìn)作用，尤其是5 min加熱處理的肉樣，其CEL含量增加13%～61%。山奈、白芷、香葉對(duì)豬肉加熱過程中AGEs形成的潛在促進(jìn)作用的機(jī)理有待進(jìn)一步明確。此外，其他常用香料，如八角、小茴香等或者復(fù)合香料對(duì)肉類食品加工及儲(chǔ)藏過程中AGEs形成的影響尚待研究，這些研究將有助于預(yù)測(cè)肉類食品在不同的加工條件下AGEs的形成規(guī)律，對(duì)肉制品的工業(yè)生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。