羅靖瑩，賀宏麗，郭陽，黃瑋瑋，黃曉波

(電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院/四川省人民醫(yī)院，成都610072)

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)作為一種具有多向分化潛能的細(xì)胞，因其在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和臨床試驗(yàn)中對(duì)各種疾病的治療效果受到廣泛關(guān)注。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)常被作為細(xì)胞再生的理想供體細(xì)胞，主要的作用機(jī)制包括歸巢、調(diào)節(jié)免疫、轉(zhuǎn)分化及旁分泌[1～4]。外泌體是一種由脂質(zhì)雙分子層包裹的膜性囊泡，大小通常在20～100 nm。研究[5～9]顯示，外泌體廣泛存在于尿液、胸腹腔積液、乳汁、唾液等體液中，而且很多細(xì)胞可以分泌外泌體，如MSCs、血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等；外泌體內(nèi)含有各種蛋白質(zhì)、脂類和mRNA、miRNA、DNA片段等遺傳物質(zhì)，細(xì)胞間可以通過外泌體交換信息、相互作用，且免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)較低，在各種病理狀態(tài)及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞受損是炎癥反應(yīng)中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，已證實(shí)MSCs可以通過外泌體修復(fù)受損的內(nèi)皮細(xì)胞[10]。外泌體體積小且不穩(wěn)定，因此如何快速有效地分離和提取外泌體是目前面臨的主要挑戰(zhàn)。分離和提取外泌體的方法主要有離心法、免疫磁珠法、PEG沉淀法、試劑盒法等，其中常用的離心法主要有差速離心技術(shù)、密度梯度離心技術(shù)和超濾離心技術(shù)[11]。差速離心技術(shù)主要是依據(jù)粒子大小和密度設(shè)置不同的離心力，通過平衡沉降原理來分離外泌體。密度梯度離心技術(shù)通常采用蔗糖作為分離介質(zhì)，與重水一起配置成1.1～1.19 g/mL的密度墊，根據(jù)不同沉降系數(shù)物質(zhì)在離心力作用下的分層分布，以此分離出外泌體[12]。超濾離心技術(shù)是在一定壓力下使溶質(zhì)通過不同孔徑的濾膜，從而篩選出外泌體。2018年6月2日～2018年9月1日，本研究觀察了差速離心、密度梯度離心、超濾離心技術(shù)在BMSCs外泌體提取中的應(yīng)用，篩選外泌體最佳離心提取方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 BMSCs、肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(PMVECs)購自美國sciencell公司，DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，抗CD9、CD63、Alix、GAPDH購自R&D公司，山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗鼠IgG-HRP購自美國 Abcam 公司，BCA蛋白試劑盒購自凱基公司，透射電子顯微鏡購自Philips公司，細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，超速離心機(jī)購自Beckman公司，熒光酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及外泌體的提取 BMSCs、PMVECs分別在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用含有10%胎牛血清(FBS)和5%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。取第4～5代BMSCs培養(yǎng)至60%～70%融合時(shí)，更換為無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞上清360 mL，平均分成A、B、C組，每組120 mL，分別使用差速離心技術(shù)、密度梯度離心技術(shù)、超濾離心技術(shù)提取外泌體。記錄各組外泌體提取時(shí)間。①差速離心技術(shù)提取外泌體。取A組細(xì)胞上清以3 000×g離心20 min，去除細(xì)胞碎片和大分子物質(zhì)，在4 ℃條件下100 000×g離心60 min，棄上清，加入4 ℃的PBS重懸，然后在4 ℃條件下100 000×g離心60 min，將沉淀物用200 μL預(yù)冷的PBS重懸，用0.22 μm濾過膜過濾，即得BMSCs外泌體。②密度梯度離心技術(shù)提取外泌體。取B組細(xì)胞上清以300×g離心10 min，去除細(xì)胞碎片和大分子物質(zhì)，10 000×g離心30 min，去除微泡，延離心管壁緩慢加入4 mL 30%蔗糖溶液，形成一單層，在4 ℃條件下100 000×g離心90 min，棄上清，將蔗糖層重懸于PBS中，再在4 ℃條件下100 000×g離心90 min，將獲得的沉淀物重懸于200 μL預(yù)冷的PBS中，即得BMSCs外泌體。③超濾離心技術(shù)提取外泌體。在超濾離心管中加入PBS緩沖液，室溫條件下3 000×g離心15 min，去除甘油和其他保存劑；取C組細(xì)胞上清以17 000×g離心15 min，然后加入超濾離心管中以3 000×g離心30 min，用200 μL PBS重懸超濾膜上的沉淀物，即得BMSCs外泌體。

1.3 A、B、C組外泌體形態(tài)觀察 采用負(fù)染色技術(shù)。向載樣銅網(wǎng)上分別加入提取的A、B、C組外泌體混懸液20 μL，室溫靜置3 min后用濾紙吸干液體，再加入30 μL的3%磷鎢酸溶液負(fù)染5 min，濾紙吸干、晾干，透射電鏡下觀察各組外泌體形態(tài)。

1.4 A、B、C組外泌體濃度及大小測算 取A、B、C組外泌體懸液100 μL稀釋于2 mL PBS內(nèi)，使用納米顆粒跟蹤分析儀(Nanosight)測算各組外泌體濃度，并根據(jù)每個(gè)粒子的布朗運(yùn)動(dòng)與斯托克斯-愛因斯坦(Stokes-Einstein)方程測算各組外泌體大小。

1.5 A、B、C組外泌體總蛋白及表面標(biāo)志蛋白CD9、CD63、Alix的檢測 ①采用BCA法測定A、B、C組外泌體總蛋白濃度。②采用Western blotting法檢測A、B、C組外泌體表面標(biāo)志蛋白CD9、CD63、Alix。取A、B、C組外泌體懸液100 μL，加入RIPA裂解液于冰上裂解10 min，使用超聲破碎外泌體后于4 ℃條件下15 000×g離心10 min，制得各組外泌體蛋白樣本。取各組外泌體蛋白樣本與上樣緩沖液混合煮沸5 min使蛋白變性，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干時(shí)轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉，加入一抗，4 ℃過夜，TBST清洗3次，加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，TBST清洗3次，以GAPDH為內(nèi)參，ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測各組外泌體表面標(biāo)志蛋白CD9、CD63、Alix灰度值，計(jì)算各組外泌體表面標(biāo)志蛋白CD9、CD63、Alix的相對(duì)表達(dá)量。外泌體表面標(biāo)志蛋白的相對(duì)表達(dá)量=外泌體表面標(biāo)志蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.6 外泌體內(nèi)皮細(xì)胞通透性檢測 采用100 ng/mL的脂多糖(LPS)干預(yù)PMVECs 6 h構(gòu)建內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型。采用Transwell小室進(jìn)行葡聚糖滲漏實(shí)驗(yàn)。將PMVECs分成5組，EC組上室加入1×105個(gè)PMVECs以及100 μL完全培養(yǎng)基；LPS組上室加入1×105個(gè)PMVECs以及100 μL 含100 ng/mL LPS的完全培養(yǎng)基；A、B、C組上室加入方法同LPS組，下室分別加入A、B、C組外泌體100 μg，用不含酚紅、血清的培養(yǎng)基重懸至400 μL。各組上室棄上清，加入不含酚紅、血清的培養(yǎng)基配制的FITC-葡聚糖(40 kDa，0.5 mg/mL)100 μL，下室加入等濃度無FITC標(biāo)記的葡聚糖100 μL，37 ℃、5% CO2、避光條件下培養(yǎng)40 min，吸取上、下室液體各100 uL，在激發(fā)光波長490/485 nm、發(fā)射光波長525/530 nm處，采用熒光酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度，計(jì)算內(nèi)皮細(xì)胞通透系數(shù)。內(nèi)皮細(xì)胞通透系數(shù)=([A]/t)×(1/A)×(v/[L])。其中[A]為下室熒光強(qiáng)度；t為時(shí)間，單位為s；A 為濾過面積，單位為cm2；v 為下室液體量；[L]為上室熒光強(qiáng)度。各組外泌體內(nèi)皮細(xì)胞通透性以各組內(nèi)皮細(xì)胞通透指數(shù)表示。各組內(nèi)皮細(xì)胞通透指數(shù)=各組內(nèi)皮細(xì)胞通透系數(shù)/EC組內(nèi)皮細(xì)胞通透系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 A、B、C組外泌體提取時(shí)間比較 A、B、C組的外泌體的提取時(shí)間分別為(180±8)、(203±10)、(40±5)min，A、B組外泌體的提取時(shí)間與C組相比，P均<0.05；A組外泌體的提取時(shí)間與B組相比，P>0.05。

2.2 A、B、C組外泌體形態(tài)比較 如圖1所示，各組外泌體均為大小不等的橢圓形或圓形的膜性結(jié)構(gòu)，邊界清晰，但僅A組外泌體可見到典型的杯狀結(jié)構(gòu)。

2.3 A、B、C組外泌體濃度及大小比較 A、B、C組的外泌體濃度分別為(4.46±0.38)×108/mL、(5.11±0.16)×108/mL、(2.18±0.17)×108/mL，A、B組與C組外泌體濃度相比，P均<0.05；A組與B組外泌體濃度相比，P>0.05。A、B、C組的外泌體大小均為20～100 nm。

2.4 A、B、C組外泌體總蛋白濃度及表面標(biāo)志蛋白CD9、CD63、Alix的表達(dá)比較 如表1所示， A、B組外泌體總蛋白濃度及CD63、Alix的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于C組(P均<0.05)。

表1 A、B、C組外泌體表面標(biāo)志蛋白CD9、CD63、Alix的表達(dá)比較

注：與C組相比，﹡P<0.05。

2.5 A、B、C、LPS、EC組內(nèi)皮細(xì)胞通透指數(shù)比較 A、B、C、LPS、EC組內(nèi)皮細(xì)胞通透指數(shù)分別為2.17±0.15、1.77±0.32、2.37±0.42、2.93±0.15、1.00±0.00，A、B、C、LPS組的內(nèi)皮細(xì)胞通透指數(shù)與EC組相比，P均<0.05；a、b組的內(nèi)皮細(xì)胞通透指數(shù)與LPS組相比，P均<0.05；其余各組間相比，P均>0.05。

3 討論

BMSCs是成體干細(xì)胞的一種，具有高度自我更新能力和多向分化潛能，且具有免疫調(diào)節(jié)作用，是組織工程學(xué)中常用的種子細(xì)胞，其對(duì)臨床上常見的急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征、心肌梗死、糖尿病、肝腎功能衰竭等多種疾病的治療效果受到了廣泛的關(guān)注。隨著研究的深入進(jìn)展，研究人員發(fā)現(xiàn)MSCs主要是通過旁分泌機(jī)制進(jìn)行組織器官的保護(hù)[13]。胞外囊泡(EV)被認(rèn)為是細(xì)胞間信息交流和物質(zhì)傳遞的新機(jī)制[14]。根據(jù)粒徑大小和分泌機(jī)制的不同，EV可分為100～1000 nm的微泡(MV)和20～100 nm的外泌體。研究[15]顯示，外泌體易獲取、易儲(chǔ)存，無致瘤性，在再生醫(yī)學(xué)、器官移植、疾病診斷和藥物傳遞等方面發(fā)揮了不可或缺的作用，但目前并無標(biāo)準(zhǔn)的分離提取技術(shù)，如何提高濃度、保證純度、維持活性、節(jié)約時(shí)間，是目前臨床亟需解決的問題。

本研究首先采用差速離心技術(shù)、密度梯度離心技術(shù)和超濾離心技術(shù)提取BMSCs外泌體，隨后對(duì)分離提取的外泌體進(jìn)行了比較。各組外泌體提取時(shí)間對(duì)比顯示，超濾離心技術(shù)提取外泌體用時(shí)最少；通過透射電鏡和Nanosight觀察到，3種方法均可以分離出大小不等的橢圓形或圓形的膜性結(jié)構(gòu)，大小在20～100 nm；通過BCA蛋白定量法和NTA公式計(jì)算出，密度梯度離心技術(shù)提取的外泌體總蛋白和外泌體濃度最高，差速離心技術(shù)其次，超濾離心技術(shù)最低；3種方法提取的外泌體均可表達(dá)特異性表面標(biāo)志物CD9、CD63、Alix，差速離心技術(shù)和密度梯度離心技術(shù)CD63和Alix的表達(dá)明顯高于超濾離心技術(shù)，說明超濾離心技術(shù)分離出來的外泌體濃度和純度均較低。

PMVECs既是急性肺損傷時(shí)的受害者，也是啟動(dòng)者，在急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)發(fā)生時(shí)，PMVECs的通透性顯著升高。本研究通過LPS干預(yù)PMVECs構(gòu)建了內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，觀察各離心技術(shù)提取的外泌體對(duì)受損內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)作用，結(jié)果顯示，與LPS組相比，A、B組外泌體內(nèi)皮細(xì)胞通透指數(shù)顯著下降，說明差速離心技術(shù)和密度梯度離心技術(shù)提取的外泌體具有更強(qiáng)的內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)能力，可能與差速離心技術(shù)和密度梯度離心技術(shù)提取的外泌體濃度和純度更高有關(guān),但后期仍需研究更多的內(nèi)皮細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

差速離心技術(shù)步驟簡單，產(chǎn)物純度高。但差速離心技術(shù)也有一定的缺點(diǎn)，反復(fù)的離心提純過程會(huì)造成外泌體丟失及影響囊膜的完整性，且易形成聚合物[16]；密度梯度離心技術(shù)提取產(chǎn)物更純，且不影響外泌體的活性，但是準(zhǔn)備工作繁瑣，程序復(fù)雜且耗時(shí)長。超濾離心技術(shù)過程簡單、速度快，但可能存在雜蛋白污染，部分外泌體也可能黏附于濾膜上導(dǎo)致產(chǎn)物損失以及活性喪失[17]。

綜上所述，密度梯度離心技術(shù)雖耗時(shí)較長，但提取的外泌體純度、濃度較高，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)作用較強(qiáng)，可以作為科研和臨床研究的首選外泌體離心提取方法。