劉圣金，喬婷婷，馬瑜璐，房 方，林瑞超，孫云飛，吳德康?

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省中藥功效物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；3.江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

治糜康栓，曾用名治糜靈栓，為通化金馬藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)的中藥復(fù)方栓劑，現(xiàn)收載于2015年版 《中國(guó)藥典》（一部）［1］。由黃柏、苦參、兒茶、枯礬和冰片5 味中藥加工制成的陰道栓，具有清熱解毒、燥濕收斂的功效。礦物藥枯礬為白礬的炮制品，是治糜康栓的生產(chǎn)原料之一。本課題組前期研究表明［2-3］，目前市場(chǎng)流通的白礬藥材有2種，1種為鉀明礬即成分主含含水硫酸鋁鉀［KAl（SO4）2·12H2O］，由硫酸鹽類礦物明礬石加工提煉制成；另1種為銨明礬即成分主含含水硫酸鋁銨［NH4Al（SO4）2·12H2O］，由化學(xué)合成制得，多用于化工，不作為藥用。鉀明礬為現(xiàn)行版《中國(guó)藥典》 收載品種，為白礬的正品，銨明礬為枯礬常見(jiàn)的偽品。對(duì)市場(chǎng)收集的32 批白礬藥材鑒定顯示，僅有8 批為鉀明礬，合格率25.0%；檢測(cè)近40 批枯礬樣品測(cè)定，合格率僅為10.5%。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)流通白礬藥材多為化學(xué)合成，僅少數(shù)白礬藥材是通過(guò)礬礦的采礦、選礦、熟化、溶解、純化、結(jié)晶等工藝制得，這種現(xiàn)狀給臨床用藥的安全性、有效性帶來(lái)了隱患。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)自制10 批正品治糜康栓（方中枯礬為鉀明礬制備）和6 批偽品治糜康栓（方中枯礬為銨明礬制備），以微波消解-ICP-OES／MS 技術(shù)測(cè)定樣品中各無(wú)機(jī)元素的含有量，研究正品和偽品治糜康栓的差異特征元素及其無(wú)機(jī)元素特征譜，為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

Perkin Elmer 350 D 電感耦合等離子體-質(zhì)譜儀、Perkin Elmer Optima 8000 電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜儀（美國(guó) Perkin Elmer 公司）；Mettler Toledo ME104E 電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；工業(yè)高純氬氣（南京天澤氣體有限責(zé)任公司）。

Al、K、Fe、Hg、Au 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，含 As、Ba、Be、Cd、Cr、Cu、Ga、Mn、Ni、Pb、Sb、Sn、Tl、Zn 的多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg／mL），Ge、In、Tb 的多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 μg／mL）（國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心）；調(diào)諧液為Be、Ce、Fe、In、Li、Mg、Pb、U 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 μg／L，美國(guó) PE 公司）。65% 硝酸（優(yōu)級(jí)純，德國(guó)Merck 公司）；超純水。10 批正品治糜康栓樣品和6 批偽品治糜康栓樣品，見(jiàn)表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定條件［3-6］

2.1.1 ICP-OES 工作參數(shù) RF 功率 1 300 W；霧化氣體積流量 0.55 L／min；輔助氣體積流量0.2 L／min；冷卻氣體積流量 12 L／min；樣品提升量1.5 mL／min；延遲時(shí)間 30 s；重復(fù)次數(shù) 1；測(cè)量方式為標(biāo)準(zhǔn)曲線法。待測(cè)元素分析線（nm）分別為 Al 396.153、K 766.490、Fe 238.204。

2.1.2 ICP-MS 工作參數(shù) RF 功率 1 100 W；霧化氣體積流量 0.92 L／min；輔助氣體積流量1.2 L／min；冷卻氣體積流量 15 L／min；碰撞氣（氦氣）體積流量 3 mL／min；采樣錐孔徑1.1 mm；截取錐孔徑0.9 mm；超級(jí)截取錐孔徑1.0 mm；積分時(shí)間1 s；延遲時(shí)間40 s；掃描方式為單點(diǎn)跳峰；重復(fù)次數(shù)3。見(jiàn)表2。

表2 ICP-MS 待測(cè)元素質(zhì)量數(shù)、檢測(cè)模式與內(nèi)標(biāo)元素Tab.2 Mass，detection mode and internal standards of ICP-MS determined elements

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備［3，7-9］

2.2.1 Al、K、Fe、Hg 對(duì)照品溶液制備 精密量取 Al、K、Fe、Hg 單元素標(biāo)準(zhǔn)液適量，用 3%HNO3溶液稀釋制成每1 mL 對(duì)照品溶液含Al，K元素量均為 0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、50、100、200 μg，含 Fe 元素 0.05、0.1、0.5、1、5、10 μg，含 Hg 元 素 0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 ng。

2.2.2 含多元素對(duì)照品溶液制備 精密量取多元素標(biāo)準(zhǔn)品貯備液適量，用3%HNO3溶液稀釋制成每 1 mL 含 As、Ba、Be 3種元素 0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、50、100 ng 的系列質(zhì)量濃度混合溶液。

2.3 內(nèi)標(biāo)溶液制備 精密量取Ge、In、Tb 多元素標(biāo)準(zhǔn)液適量，用3%HNO3溶液配制制成每1 mL 含Ge、In、Tb 10 ng 的混合內(nèi)標(biāo)溶液。

2.4 供試品溶液制備 將各治糜康栓樣品剪碎，樣品取碎塊約0.2 g，精密稱定，精確加入HNO36 mL，于通風(fēng)廚中靜置 30 min，后于電熱板上80 ℃進(jìn)行預(yù)消解，待反應(yīng)40 min 后，再精確加入H2O22 mL，繼續(xù)反應(yīng)至無(wú)明顯泡沫后，加蓋密封，裝入微波消解儀中，按預(yù)設(shè)程序進(jìn)行消解，程序見(jiàn)表3。消解完成后，待溫度降至70 ℃以下，取出消解罐，置于電熱板上100 ℃加熱揮酸，然后將消解液轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶中，加入200 μL Au 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 μg／mL），用超純水定容至刻度，搖勻，即為各供試品溶液。除不加Au 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液外，同法制備試劑空白溶液。所得到的樣品消解液無(wú)色、澄清透明、無(wú)固體殘?jiān)砻鳂悠繁煌耆狻?/p>

表3 微波消解程序Tab.3 Digestion programs

2.5 方法學(xué)考察［10-14］

2.5.1 線性關(guān)系考察 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，制備對(duì)照品溶液。根據(jù)待測(cè)元素ICP-MS、ICP-OES 測(cè)定方法，上機(jī)檢測(cè)18種無(wú)機(jī)元素不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，ICP-MS 以對(duì)照品分析峰響應(yīng)值與內(nèi)標(biāo)元素參比峰響應(yīng)值的比值為縱坐標(biāo)（I），ICP-OES 測(cè)定縱坐標(biāo)為對(duì)照品分析峰響應(yīng)值，對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（C），進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.5.2 檢測(cè)限 重復(fù)測(cè)定空白樣品溶液10 次，根據(jù)IUPAC 規(guī)則以3 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為各元素的方法檢出限。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知檢測(cè)限范圍為 0.001～2.380 μg／L，能滿足待測(cè)無(wú)機(jī)元素分析需求，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取治糜康栓供試品溶液，連續(xù)測(cè)定6 次，計(jì)算各待測(cè)元素 RSD 在 0.05～4.34之間，表明該方法精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取治糜康栓小塊約0.2 g，精密稱定，平行6 份，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各待測(cè)元素 RSD 在 0.93～6.33 之間，表明該方法精密度良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知元素含有量的治糜康栓樣品約0.2 g，精密稱定，平行 9 份，分別加入各元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量。按 “2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，同法測(cè)定，計(jì)算各待測(cè)元素加樣回收率范圍均在80%～120%，結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 各元素線性關(guān)系和檢測(cè)限Tab.4 Linear relationships and detection limits of various elements

表5 各元素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.5 Results of recovery tests for various elements（n=9）

2.6 樣品含有量測(cè)定 在上述方法學(xué)考察基礎(chǔ)上，取供試品溶液依次測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。顯示，常量元素正品治糜康栓中K 含有量最高，均值為2.41×104mg／kg，Al、Fe 次之，均值分別為 1.37×104、6.37×10 mg／kg；偽品治糜康栓中 Al 含有量最高，均值為 1.49×104mg／kg，K、Fe 次之，均值分別為3.86×103mg／kg、4.32×102mg／kg。微量元素正品治糜康栓中Mn、Zn、Cr 含有量最高，均值分別為9.738、5.980、1.229 mg／kg，其他微量元素含有量均低于 1.000 mg／kg；偽品治糜康栓中 Mn、Zn、Ga、Cr 的含有量最高，均值分別為 15.477、5.965、2.000、1.432 mg／kg，其他微量元素含有量均低于1.000 mg／kg。2 類樣品中重金屬及有害元素含有量由高到低均依次為 Cu、As、Pb、Cd、Hg，正品治糜康栓中均值分別為2.497、0.142、0.079、0.002、0.001 mg／kg，偽品治糜康栓中均值分別為2.318、0.250、0.121、0.002、0.001 mg／kg，大部分樣品未檢出Hg。

2.7 聚類分析 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件組間平均鏈鎖法進(jìn)行分層聚類分析，Z score 法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，測(cè)度選用歐氏距離平方，結(jié)果見(jiàn)圖1。表明，16 批治糜康栓樣品聚為兩大類，ZP1～ZP10（正品治糜康栓組）聚為一類，WP1～WP6（偽品治糜康栓組）聚為一類，表明兩類治糜康栓樣品中無(wú)機(jī)元素的含有量特征存在明顯的差異。

圖1 16 批樣品聚類樹(shù)狀圖Fig.1 Dendrogram of sixteen batches of samples

2.8 差異性無(wú)機(jī)元素識(shí)別［3-10］圖2 表明，利用SIMCA-P 13.0 分析軟件對(duì)16 個(gè)正品和偽品治糜康栓樣品進(jìn)行主成分分析，獲得樣品的主成分分析得分圖，可知，16 批樣品分為明顯的 2 個(gè)區(qū)域，與聚類分析結(jié)果相同，其中正品治糜康栓分布在-2.93＜PC1＜-1.86，-1.07＜PC2＜2.20 的區(qū)域，偽品治糜康栓分布在 3.17＜PC1＜4.72，-4.04＜PC2＜2.52 的區(qū)域。各元素分布載荷圖見(jiàn)圖3，提示離中心較近的分布是正品治糜康栓和偽品治糜康栓兩類樣品中含有量相差較小的元素，離中心較遠(yuǎn)分布的為含有量相差較大的元素。通過(guò)t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)比較樣品中差異性無(wú)機(jī)元素，共篩選出12種元素含有量具有顯著性差異（P＜0.05），分別為 Be、Al、K、Mn、Fe、Ni、Ga、As、Sn、Ba、Tl、Pb。

表6 各無(wú)機(jī)元素含有量測(cè)定結(jié)果（mg／kg）Tab.6 Results of content determination of various inorganic elements（mg／kg）

圖2 16 批樣品主成分分析圖Fig.2 PCA plot for sixteen batches of samples

2.9 無(wú)機(jī)元素特征譜建立［3-10］根據(jù)不同元素測(cè)定結(jié)果，篩選16種共有元素，取各元素含有量的平均值，建立正品治糜康栓和偽品治糜康栓的無(wú)機(jī)元素特征圖譜。以便于繪圖，縱坐標(biāo)以對(duì)數(shù)Log10的形式表示。以方便比較，將正品、偽品治糜康栓的無(wú)機(jī)元素特征圖譜集中繪制，見(jiàn)圖4?？芍瑑深悩悠返臒o(wú)機(jī)元素特征圖譜的走勢(shì)存在差異，如K、Ga 處走勢(shì)具明顯差異，因此可以利用該特征圖譜鑒別正品、偽品治糜康栓。

圖3 16 批樣品主成分分析載荷圖Fig.3 Loadings scatter plot of principal component analysis of sixteen batches of samples

3 討論

正品治糜康栓中 Cu、As、Cd、Hg、Pb 的平均含有量分別為 2.497、0.142、0.002、0.001、0.079 mg／kg，偽品治糜康栓中平均含有量分別為2.318、0.250、0.002、0.001、0.121 mg／kg。在2015年版《中國(guó)藥典》（一部）收載的39種含礦物藥外用制劑中，僅婦必舒陰道泡騰片有明確的Cu、As、Cd、Hg、Pb 限量規(guī)定，即 Cu ≤20 mg／kg、As≤2 mg／kg、Cd≤0.3 mg／kg、Hg≤0.2 mg／kg、Pb≤5 mg／kg。2007年版 《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》［15］中對(duì) Hg、Pb、As 的限量值分別為 Hg≤1 mg／kg（含有機(jī)汞防腐劑的眼部化妝品除外）、Pb≤40 mg／kg、As≤10 mg／kg。參照上述標(biāo)準(zhǔn)，正品治糜康栓和偽品治糜康栓中重金屬及有害元素的含有量均未超出限量要求。

圖4 16 批樣品無(wú)機(jī)元素特征圖譜Fig.4 Characteristic spectrum of inorganic elements of sixteen batches of samples

通過(guò)微波消解ICP-OES／MS 技術(shù)對(duì)正品、偽品治糜康栓中18種無(wú)機(jī)元素進(jìn)行含有量測(cè)定，正品治糜康栓中K 含有量最高，偽品治糜康栓Al 含有量最高。對(duì)16 批樣品進(jìn)行聚類分析，分為正品治糜康栓和偽品治糜康栓兩類，并從中篩選得到12種含有量具有顯著性差異（P＜0.05）的元素。正品、偽品治糜康栓差異性特征元素及無(wú)機(jī)元素特征譜，可作為治糜康栓質(zhì)量控制手段之一。此外，正品、偽品治糜康栓中無(wú)機(jī)元素含有量及分布規(guī)律的差異性是否會(huì)對(duì)糜康栓的安全性與有效性產(chǎn)生影響，有待進(jìn)一步深入研究。