陳景斯，李奕彤，王曉佳，蔡延渠，黃晶晶，朱志東，董碧蓮

（1.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006；2.廣州市番禺區(qū)婦幼保健院，廣東 廣州 511400；3.廣東藥科大學新藥研發(fā)中心，廣東 廣州 510006）

油茶Camellia oleiferaAbel.是山茶科山茶屬植物，為多年生小喬木或灌木，在全國各地均有種植，以湖南、江西等省份產(chǎn)量最高。油茶果殼為油茶籽的外種皮，約占油茶果實總質量的一半多，主要成分有木質素、多縮戊糖、茶皂素、鞣質等［1-2］，具有神經(jīng)保護、抗氧化、抗腫瘤、降血糖［3-6］等生物活性，目前它主要用于制備糠醛、木糖醇、栲膠、活性碳、培養(yǎng)基等，經(jīng)濟、社會效益均比較低，嚴重影響了種植戶的積極性。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，多糖物質具有較好的吸濕保濕性能及營養(yǎng)肌膚、無刺激等作用，在化妝美容產(chǎn)品、術后創(chuàng)傷修復［7］等領域中具有潛在應用價值。因此，為了更好地提高油茶果殼附加值，有效增加經(jīng)濟、社會效益，本實驗從工業(yè)化生產(chǎn)的角度考慮，采用正交試驗優(yōu)化油茶果殼多糖的乙醇提取工藝，同時對其吸濕保濕性能進行評價，為該成分在保健、護膚等方面的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 UV-1700 雙光束紫外分光光度計［島津企業(yè)管理（中國）有限公司］；EPED-10TF 純水器（南京益普易達科技發(fā)展有限公司）；D05 臺式大容量低速離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）；BP-211D 電子分析天平（德國 Sartorius 公司）；JJ1000Y 電子天平［0.01 g，美國雙杰（兄弟）集團有限公司］；RE-52 旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥 油茶果殼產(chǎn)地廣東龍川，由廣東龍川恒海油脂有限公司提供，采集期為2016年10月，經(jīng)廣東藥科大學李苑新副研究員鑒定為山茶科山茶屬植物油茶Camellia OleiferaAbel.的干燥果殼。D-無水葡萄糖對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110833-201506），苯酚、濃硫酸、海藻酸鈉、氯化鈣、醋酸鉀、硫酸銨、無水乙醇、氯化鈉等均為分析純。

2 方法與結果

2.1 多糖提取物制備 果殼在60 ℃下烘干后粉碎，過 80 目篩，精密稱取 20 g 于圓底燒瓶中，加入30 倍量60%乙醇浸泡1 h，100 ℃下加熱回流提取 3 次，每次 1 h，合并濾液，抽濾后取上清液濃縮至適量，冷凍干燥至恒定質量，粉碎，過100 目篩，即得。

2.2 多糖含有量測定［8-9］

2.2.1 溶液制備

2.2.1.1 對照品溶液 將D-無水葡萄糖對照品烘干至恒定質量，精密稱取10.09 mg 于100 mL 量瓶中，純水溶解，定容，即得（0.100 9 mg／mL）。

2.2.1.2 供試品溶液 將多糖提取物烘干至恒定質量，精密稱取 50.33 mg 于 200 mL 量瓶中，180 mL 純水超聲溶解，定容，即得（0.251 7 mg／mL）。

2.2.2 線性關系考察 吸取D-無水葡萄糖對照品溶液 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，加入純水 0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3 mL，再依次加入 5% 苯酚 1.0 mL、濃硫酸 5.0 mL，沸水浴20 min，取出冷卻至室溫；另外吸取純水1.0 mL，加入等量苯酚、濃硫酸同法操作，作為空白對照。然后，取各溶液適量于比色皿中，于490 nm 波長處測定吸光度，以D-無水葡萄糖質量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（A）進行回歸，得方程為Y=0.069X＋0.021（R2=0.999 0），在2.88～10.09 μg／mL 范圍內呈良好的線性關系。

2.2.3 精密度試驗 吸取D-無水葡萄糖對照品溶液0.5 mL，按 “2.2.3”項下方法測定吸光度 6次，測得其RSD 為0.46%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 重復性試驗 按 “2.2.2”項下方法制備多糖溶液，平行6 份，各吸取 1.0 mL，按“2.2.3”項下方法測定吸光度，測得其 RSD 為0.73%，表明該方法重復性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 按 “2.2.2”項下方法制備供試品溶液，吸取 1.0 mL，每隔0.5 h 按 “2.2.3”項下方法測定吸光度，連續(xù) 4 h，測得其 RSD 為0.85%，表明供試品溶液在4 h 內穩(wěn)定性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗 吸取 “2.2.2”項下含有量已知的多糖溶液0.50 mL，加入0.100 9 mg／mLD-無水葡萄糖對照品溶液0.18、0.23、0.28 mL 和純水 1.32、1.27、1.22 mL，按 “2.2.3”項下方法測定吸光度，測得其平均加樣回收率分別為98.37%、98.62%、98.65%，RSD 分別為 0.33%、0.42%、0.35%。

2.2.7 多糖得率測定［10］將多糖溶液按 “2.2.3”項下方法測定吸光度，計算多糖質量，再測定其得率，公式為得率=（溶液中多糖質量／果殼質量）×100% 。

2.3 單因素試驗［11-12］

2.3.1 乙醇體積分數(shù) 稱取40 目果殼粉末20 g，按料液比 1 ∶20 加入 30%、40%、50%、60%、70% 、80% 乙醇，浸泡 1 h 后提取 2 次，每次 1 h，按 “2.2.1”項下方法制備多糖溶液，考察乙醇體積分數(shù)對多糖得率的影響，結果見圖1。由圖可知，隨著乙醇體積分數(shù)提高，多糖得率明顯上升，在60%時達到最大，之后呈現(xiàn)下降趨勢。

圖1 乙醇體積分數(shù)對多糖得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on polysaccharides yield

2.3.2 粉末粒徑 稱取 24、40、60、80、100、120 目果殼粉末 20 g，按料液比 1 ∶20 加入 60% 乙醇，浸泡 1 h 后提取 2 次，每次 1 h，按 “2.2.1”項下方法制備多糖溶液，考察粉末粒徑對多糖得率的影響，結果見圖2。由圖可知，隨著粉末粒徑減小，多糖得率逐漸提高，在80 目時最高，之后呈現(xiàn)下降趨勢。

圖2 粉末粒徑對多糖得率的影響Fig.2 Effect of powder particle size on polysaccharides yield

2.3.3 提取溫度 稱取80 目果殼粉末20 g，按料液比 1 ∶20 加入 60% 乙醇，浸泡 1 h 后于 60、70、80、90、100 ℃下回流提取 2 次，每次 1 h，按 “2.2.1”項下方法制備多糖溶液，考察提取溫度對多糖得率的影響，結果見圖3。由圖可知，隨著提取溫度升高，多糖得率呈上升趨勢，在100 ℃時最高。

2.3.4 料液比 稱取80 目果殼粉末20 g，按料液比 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40 加入 60% 乙醇，浸泡 1 h 后 100 ℃ 下提取1 h，按 “2.2.1”項下方法制備多糖溶液，考察料液比對多糖得率的影響，結果見圖4。由圖可知，隨著料液比增加，多糖得率呈上升趨勢，在1 ∶30時程度趨緩。

圖3 提取溫度對多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on polysaccharides yield

圖4 料液比對多糖得率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on polysaccharides yield

2.3.5 提取時間 稱取80 目果殼粉末20 g，按料液比 1 ∶30 加入 60%乙醇，浸泡1 h 后100 ℃下提取 1、2、3、4 h，按 “2.2.1”項下方法制備多糖溶液，考察提取時間對多糖得率的影響，結果見圖5。由圖可知，隨著提取時間延長，多糖得率開始明顯上升，2 h 后有所下降。

圖5 提取時間對多糖得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on polysaccharides yield

2.3.6 提取次數(shù) 稱取80 目果殼粉末20 g，按料液比1 ∶30 計算60%乙醇總量，根據(jù)提取次數(shù)平均分配加入量，浸泡 1 h 后 100 ℃下提取 1、2、3、4次，每次 1 h，按 “2.2.1”項下方法制備多糖溶液，考察提取次數(shù)對多糖得率的影響，結果見圖6。由圖可知，多次提取有利于提高多糖得率，其中提取2 次時最高，但次數(shù)過多時損耗增加，反而導致其下降。

圖6 提取次數(shù)對多糖得率的影響Fig.6 Effect of extraction frequency on polysaccharides yield

2.4 正交試驗［10-11］根據(jù)單因素試驗結果，同時考慮實際工業(yè)化生產(chǎn)方式，本實驗固定粉末粒徑、提取溫度分別為80 目、100 ℃，并選擇乙醇體積分數(shù)（A）、料液比（B）、提取時間（C）、提取次數(shù)（D）作為影響因素，采用 L9（34）正交試驗優(yōu)化提取工藝。因素水平見表1。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

直觀分析（表2）顯示，各因素影響程度依次為 A＞D＞C＞B；方差分析（表3）顯示，因素 A 具有顯著性差異（P＜0.05），最優(yōu)工藝為 A2B3C1D2，即乙醇體積分數(shù)60%，料液比1 ∶35，提取2 次，提取時間1.5 h。

表2 試驗設計及結果Tab.2 Design and results of tests

然后，按優(yōu)化工藝（平行稱取一定量80 目果殼粉末 3 份，按料液比 1 ∶35 加入 60% 乙醇，浸泡1 h 后 100 ℃下提取 2 次，每次 1.5 h）進行 3 批驗證試驗，結果見表4，可知該工藝穩(wěn)定可行。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

表4 驗證試驗結果（n=3）Tab.4 Results of verification tests（n=3）

2.5 吸濕保濕性能研究［13-15］

2.5.1 吸濕性能 將飽和醋酸鉀、硫酸銨溶液于室溫下置于干燥器中預飽和12 h，分別形成相對濕度43%、81%的環(huán)境。精密稱取多糖粉末、海藻酸鈉各2.0 g 于培養(yǎng)皿中，平行制備3 份樣品，置于以上不同濕度的干燥器內，于 1、3、6、9、12、18、24、36、48 h 取出稱定質量，計算吸濕率，公式為吸濕率=［（Wn-W0）／W0］×100%（W0、Wn分別為樣品放置前、放置后的質量）。

圖7顯示，相對濕度 43% 下多糖在 0～6 h 內的吸濕率與海藻酸鈉趨于平行，6～12 h 內緩慢上升，12 h 后加快，但增幅均低于后者。整體而言，0～48 h 內海藻酸鈉吸濕率大于多糖，上升趨勢線k值分別為2.743、2.425，但兩者無明顯差異。

圖7 相對濕度43%下樣品吸濕曲線Fig.7 Moisture-absorption curves for samples under the relative humidity of 43%

圖8顯示，相對濕度81%下多糖在 0～12 h 內的吸濕率略低于海藻酸鈉，12～36 h 內略高于后者，36～48 h 內又略低于后者。整體而言，0～48 h內多糖吸濕率大于海藻酸鈉，上升趨勢線k值分為4.693、4.296，但兩者無明顯差異。

圖8 相對濕度81%下樣品吸濕曲線Fig.8 Moisture-absorption curves for samples under the relative humidity of 81%

2.5.2 保濕性能 將飽和氯化鈣溶液于室溫下置于干燥器中預飽和12 h，形成相對濕度34% 的環(huán)境。精密稱取多糖粉末、海藻酸鈉各2.0 g，加入1.0 g 純水制成樣品溶液，平行 3 份，稱取 2.0 g，涂布于貼在培養(yǎng)皿底部的透氣膠帶上，于1、3、6、9、12、18、24、36、48 h 取出稱定質量，計算吸濕率，公式為保濕率=Hn／H0×100%（H0、Hn分別為樣品放置前、放置后的水分質量）。

圖9顯示，相對濕度34%下海藻酸鈉、多糖在0～48 h 內的保濕率均不斷下降，前者高于后者，并且后者下降速率（k=-9.403）略快于前者（k=-8.705）。

圖9 相對濕度34%下樣品保濕曲線Fig.9 Moisture-retention curves for samples under the relative humidity of 34%

3 討論

油茶果殼多糖是由鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等多種不同單糖組成的雜多糖［5］，故溶劑極性、pH 值可能影響其溶出。預實驗對水、乙醇、酸水（pH 3～6）、堿水（pH 8～11）等不同溶劑進行篩選，發(fā)現(xiàn)以乙醇為溶劑時對油茶果殼多糖的提取效果最佳，而且在單因素、正交試驗中乙醇體積分數(shù)影響最顯著；本實驗篩選出的最優(yōu)提取工藝為80 目粉末，料液比1 ∶35，60% 乙醇 100 ℃ 下提取 2 次，每次 1.5 h，驗證試驗顯示該工藝合理可行，準確穩(wěn)定，可為相關大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

研究表明，隨著環(huán)境濕度增加，油茶果殼多糖吸濕性能提高，與海藻酸鈉接近，但保濕效果稍差于后者，其原因主要是該成分高分子鏈上的基團與水分子之間存在較強的氫鍵作用，使水分子比較容易進入凝膠，同時氫鍵作用使得整個網(wǎng)絡中的高分子鏈相互纏繞，之后逐漸解開后分散到水溶液中，可發(fā)生鏈間、水分子與鏈段之間相互作用的變化，從而表現(xiàn)出較強的吸水能力。