趙雨笛，譚 芳，嚴志凌，李盈甫，戴書穎，周紫云，張新文，劉舒媛，史 荔，姚宇峰

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，云南 昆明 650118 ；

2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院干部醫(yī)療科，云南 昆明 650032；

3.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科，云南 昆明 650118；

4.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；

5.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500

由于人口老齡化加劇、生活方式改變、環(huán)境惡化等因素的影響，全球惡性腫瘤發(fā)病率及死亡率持續(xù)增長，已成為人類死亡的首要原因［1］。除以上環(huán)境因素外，宿主因素尤其是宿主基因中的遺傳多態(tài)性在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用［2］。CD44屬于細胞黏附分子家族中的透明質(zhì)酸黏素（hyaladherin），是一種跨膜糖蛋白，由細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、細胞外結(jié)構(gòu)域及跨膜結(jié)構(gòu)域三個部分構(gòu)成，是許多細胞因子、生長因子的受體。CD44由人類第11號染色體短臂上的CD44基因編碼，全長50 kb，由20個外顯子和19個內(nèi)含子組成［3］。CD44是眾多腫瘤干細胞的標(biāo)志分子之一［4］，在腫瘤細胞中，過表達的CD44已被確認與人類許多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性［5-12］，包括宮頸癌、肺癌等［13-18］。大量研究結(jié)果顯示，CD44基因中的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與人類多種癌癥的易感性相關(guān)［19-22］?；虻?'UTR區(qū)域在miRNA參與的基因表達調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，而位于3'UTR區(qū)域的SNP位點可能通過影響miRNA的結(jié)合而影響基因的表達。因此，本研究選擇了CD44基因3'UTR區(qū)域可能與miRNA結(jié)合相關(guān)［20，23］的兩個SNP位點（rs13347C＞T、rs8193C＞T），分別研究其與云南漢族人群宮頸癌和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 對象

隨機選取2012年10月—2016年5月在昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院被確診為宮頸癌的患者497例作為宮頸癌病例組，隨機選取同期被確診為NSCLC的患者483例作為NSCLC病例組，并排除：① 術(shù)前接受放化療等抗腫瘤治療的患者；② 患有其他惡性腫瘤，或合并心血管疾病、糖尿病、肝炎、腎病等疾病的患者；③ 資料不全者。選取同期在昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院體檢的人類乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）陰性且無宮頸癌變的健康女性500名作為宮頸癌對照組，選取同期在昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院參加體檢的471名健康體檢者作為NSCLC對照組。所有參與者均為居住于云南地區(qū)的彼此無血緣關(guān)系的漢族個體，并簽署知情同意書。

1.2 樣本基因組DNA提取

采集研究對象靜脈血5 mL（EDTA或肝素鈉抗凝），使用全血基因組DNA提取試劑盒（QIAamp DNA Blood Mini Kit，德國QIAGEN公司，貨號51106）提取DNA。并用超微量紫外可見分光光度計（NanoDrop2000，美國ThermoFisher Scientific公司）檢測DNA的濃度及純度。

1.3 SNP位點基因分型

本研究采用TaqMan探針實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）對研究對象SNP位點進行基因分型。TaqMan探針分型試劑盒及分型試劑（TaqMan Genotyping Master Mix）購自美國ABI公司（http://www.appliedbiosystems.com）。其中SNP位點rs13347基因分型試劑盒編號為C_ _7619022_10；S N P位點r s 8 1 9 3基因分型試劑盒編號為C_ _2143188_1_?；蚍中褪褂肞CR儀為QuantStudio 6（美國ABI公司），PCR反應(yīng)體積為20 μL，反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性10 min，92 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，共40個循環(huán)，40 ℃長延伸5 min?；蚍中驮囼炘O(shè)陰性對照（以水代替樣本DNA）?；蚍中蛯嶒灁?shù)據(jù)采用QuantStudioTMReal-Time PCR軟件進行分析，并選取每個位點不同基因型的樣本進行測序。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析；采用Hardy-Weinberg平衡檢驗樣品代表性；采用t檢驗分析病例組和對照組間年齡是否存在差異；采用χ2檢驗分析病例組和對照組性別是否有差異，并分析病例組和對照組中CD44基因兩個SNP位點基因型、等位基因分布頻率的差異。采用SHEsis軟件計算SNP位點間的連鎖不平衡關(guān)系［24］，用D'值表示兩個位點間的連鎖關(guān)系，當(dāng)D'＞0.8時說明SNP位點間存在強連鎖。構(gòu)建存在強連鎖SNP的單倍型，并用χ2檢驗分析所構(gòu)建的單倍型在病例組和對照組之間分布頻率的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，在單倍型分析過程中的多重比較采用Bonferroni進行校正。

2 結(jié) 果

2.1 研究對象基本情況

本研究共納入宮頸癌病例組497例，宮頸癌對照組500例；NSCLC病例組483例，NSCLC對照組471例（表1）。

表 1 本研究選取病例的臨床特征Tab. 1 The clinical characteristics of the subjects enrolled in this study

2.2 研究樣本的代表性

CD44基因中的SNP位點rs13347（C＞T）、rs8193（C＞T）的基因型分布在宮頸癌病例組和對照組，以及NSCLC病例組和對照組中全部符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05），說明本研究中所選擇的樣本是具有群體代表性的隨機樣本。

2.3 CD44基因SNP位點與宮頸癌和NSCLC的相關(guān)性分析

CD44基因中的兩個SNP位點等位基因和基因型在宮頸癌組和對照組中分布特征見表2。結(jié)果顯示，rs13347（C＞T）和rs8193（C＞T）位點等位基因和基因型在宮頸癌組和對照組中的分布頻率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

CD44基因中的兩個SNP位點rs13347（C＞T）和rs8193（C＞T）位點等位基因和基因型在NSCLC組和對照組中的分布特征見表3。結(jié)果顯示，rs13347（C＞T）和rs8193（C＞T）位點等位基因在NSCLC組和對照組中分布頻率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.020和0.004）；其中rs13347位點等位基因C在NSCLC組的分布頻率顯著高于對照組，可能是NSCLC發(fā)生的風(fēng)險因素（OR=1.250，95%CI：1.035～1.509），而rs8193位點等位基因C在對照組中的分布頻率顯著高于NSCLC組，可能是NSCLC發(fā)生的保護性因素（OR=0.768，95%CI：0.641～0.921）。

表 2 CD44基因中SNP位點的等位基因和基因型在宮頸癌病例組和對照組的分布Tab. 2 Comparison of the allelic and genotypic frequencies distribution of SNPs in CD44 gene among case and control groups of cervical cancer［n(%)］

表 3 CD44基因中SNP位點的等位基因和基因型在NSCLC病例組和對照組的分布頻率Tab. 3 The allelic and genotypic frequencies of SNPs in CD44 gene between NSCLC case and control groups［n(%)］

2.4 CD44基因SNP位點間連鎖不平衡關(guān)系及單倍型分析

CD44基因SNP位點連鎖不平衡分析結(jié)果顯示，在宮頸癌和NSCLC的分析中 rs13347（C＞T）和rs8193（C＞T）之間均存在強連鎖（D'＞0.8）。根據(jù)連鎖不平衡結(jié)果構(gòu)建CD44基因SNP位點rs13347（C＞T）和rs8193（C＞T）的單倍型，并比較分布頻率大于3%的單倍型在病例和對照組中的分布頻率差異。結(jié)果顯示，rs13347和rs8193兩位點單倍型C-C、C-T和T-C在宮頸癌病例組和對照組中的分布頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。在NSCLC病例組和對照組中，rs13347（C＞T）和rs8193（C＞T）兩位點單倍型C-C的分布頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；單倍型C-T和T-C在NSCLC對照組和病例組中分布頻率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003和P=0.022），但經(jīng)Bonferroni校正后，單倍型T-C在兩組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明rs13347C-rs8193T單倍型可能是NSCLC發(fā)生的風(fēng)險因素（OR=1.316，95%CI：1.096～1.579，表4）。

表 4 CD44基因 SNP 位點單倍型與宮頸癌及NSCLC的相關(guān)性Tab. 4 The haplotype frequencies of SNPs in CD44 gene in case and control groups of cervical cancer and NSCLC［n(%)］

3 討 論

癌癥是全球主要的疾病負擔(dān)，每年新發(fā)生病例1 000多萬，我國新增病例約占全球的20%［25］，其中肺癌發(fā)病例數(shù)居全球首位，宮頸癌發(fā)病例數(shù)居全球第2位。惡性腫瘤發(fā)生過程中個體間遺傳因素的差異發(fā)揮著重要作用，基因組SNP是個體對腫瘤易感性差異的重要遺傳學(xué)基礎(chǔ)。遺傳學(xué)腫瘤標(biāo)志物已逐漸成為惡性腫瘤早期預(yù)防和診治的重要監(jiān)測指標(biāo)。

CD44廣泛表達于各類細胞表面，包括淋巴細胞、上皮細胞、中胚層細胞。CD44的過表達會干擾細胞的凋亡作用，從而促進癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力［26］。Dasari等［27］在印度人群宮頸癌研究中發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者血清中CD44水平顯著增加，這說明CD44的異常表達可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。多項研究結(jié)果表明，CD44基因多態(tài)性與多種惡性腫瘤之間有著密切的聯(lián)系，比如肺癌、胃腸癌、B細胞慢性淋巴細胞性白血病、甲狀腺癌和卵巢癌等癌癥中CD44的表達均顯著升高［28-32］。研究發(fā)現(xiàn)基因中的SNP位點可能通過多種方式對基因的表達產(chǎn)生影響，其中位于基因3'-UTR區(qū)域的SNP位點可能通過干擾miRNA的結(jié)合而干擾miRNA對靶基因表達的調(diào)控［33］。因此本研究選取了位于CD44基因3'-UTR區(qū)域的兩個多態(tài)性位點，分析其與云南漢族人群NSCLC、宮頸癌的相關(guān)性。其中rs13347（C＞T）位點位于CD44基因3'-UTR區(qū)域，可通過影響hsa-miR-509-3P對CD44的調(diào)控而影響CD44的表達［20,34-35］。Shi等［36］的研究發(fā)現(xiàn)，該多態(tài)性位點與亞洲人尤其是中國人群患某些癌癥的風(fēng)險性有關(guān)，包括膽囊癌、鼻咽癌、乳腺癌和急性髓細胞性白血病等［8,20,34-35,37］。Tulsyan等［38］在北印度人群的研究中未發(fā)現(xiàn)CD44 rs13347與乳腺癌易感性的關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示，CD44基因中的rs13347位點可能與云南漢族人群NSCLC具有相關(guān)性，而與云南漢族人群宮頸癌無相關(guān)性。綜合以上研究資料發(fā)現(xiàn)，rs13347在不同研究中發(fā)揮的作用存在不一致，造成這種不一致結(jié)果的原因可能是由于不同研究選取的人群不同造成的，通過Ensemble數(shù)據(jù)庫查詢發(fā)現(xiàn)rs13347位點等位基因及基因型在不同人群中的分布頻率差異較大（http://asia.ensembl.org/index.html）；另一個可能的原因是不同疾病的發(fā)病機制不同，所以同一SNP位點在不同疾病中發(fā)揮的作用可能不同。本研究選取的CD44基因中的另一個SNP位點rs8193(C＞T)與疾病的相關(guān)性的研究較少，本研究結(jié)果顯示，CD44基因上rs8193（C＞T）位點與云南漢族人群宮頸癌發(fā)病風(fēng)險之間無關(guān)聯(lián)性，但該位點可能與云南漢族人群NSCLC的易感性相關(guān)。3'UTR區(qū)域可以通過控制mRNA穩(wěn)定性和翻譯效率參與轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的基因調(diào)控。而rs8193位于CD44基因3'UTR中轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合區(qū)域，因此，有研究者推測轉(zhuǎn)錄因子與位于CD44基因3'UTR區(qū)域的rs8193多態(tài)性位點結(jié)合的變化使得CD44基因的轉(zhuǎn)錄活性受到影響［23,39］。

本研究分析了CD44基因中兩個多態(tài)性位點的連鎖不平衡關(guān)系，構(gòu)建了兩個位點的單倍型，并對分布頻率大于3%的單倍型在病例組和對照組中的分布差異進行了分析，結(jié)果顯示，C-T單倍型與云南漢族人群NSCLC的易感性相關(guān)。該結(jié)果與等位基因和基因型分析結(jié)果中rs13347和rs8913等位基因在NSCLC發(fā)生過程中發(fā)揮的作用相一致。

綜上所述，本研究中CD44基因中的兩個多態(tài)性位點rs13347和rs8193可能與云南漢族人群宮頸癌的易感性無關(guān)。但在NSCLC的分析中，多態(tài)性位點rs13347基因型C/C可能是肺癌發(fā)生的風(fēng)險因素；rs8193位點基因型C/C可能是NSCLC發(fā)生的保護因素，單倍型C-C則可能與NSCLC風(fēng)險增加有關(guān)。這兩個位點位于CD44基因的3'UTR區(qū)域，其中rs13347是hsa-miR-509-3P的結(jié)合序列，而rs8193可能位于轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子結(jié)合區(qū)域，兩個多態(tài)性位點均可能會對CD44的表達產(chǎn)生影響，從而與腫瘤發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性。但研究結(jié)果仍存在著爭議，因此后期會通過增加樣本量進一步分析兩個SNP位點與宮頸癌和肺癌的相關(guān)性。