趙東麗，梁憲斌，王 艷，張喜鳳，張維真

鄭州市第三人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)一科，河南 鄭州450000

近年來(lái)，我國(guó)乳腺癌發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，且出現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，已成為威脅我國(guó)女性健康的主要疾病類(lèi)型［1］。有研究指出［2］，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響乳腺癌患者預(yù)后的主要因素?；颊咭坏┏霈F(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，生存率將顯著下降［3］，但目前乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制尚未完全清楚。Prospero相關(guān)同源異形盒蛋白1（prospero-related homeobox 1，PROX1）作為同源域轉(zhuǎn)錄因子家族成員，是多種組織器官發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)蛋白，同時(shí)參與淋巴管生成過(guò)程［4］，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，PROX1參與多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程［5］，與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲過(guò)程密切相關(guān)［6］。本研究擬分析乳腺癌組織中PROX1蛋白水平，探討其與臨床病理學(xué)指標(biāo)及預(yù)后的相關(guān)性，以期為闡明乳腺癌發(fā)病機(jī)制提供參考資料。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2011年3月—2013年3月在鄭州市第三人民醫(yī)院擇期行手術(shù)治療且資料完整的乳腺癌患者85例，術(shù)前均未接受放化療，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)均為浸潤(rùn)性乳腺癌。患者均為女性，年齡31～79歲，中位年齡53歲；分化程度：低分化23例，中分化36例，高分化26例；參考第7版國(guó)際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control，UICC）與美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）關(guān)于TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：I期19例，Ⅱ期38例，Ⅲ～Ⅳ期28例；根據(jù)分子分型劃分標(biāo)準(zhǔn)分為［7］：Luminal A型25例，Luminal B型22例，人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）過(guò)表達(dá)型17例，三陰性乳腺癌（triplenegative breast cancer，TNBC）21例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例。本研究已通過(guò)鄭州市第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署了知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)

按照免疫組織化學(xué)SP法進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒及配套試劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。取乳腺癌和癌旁組織（距離癌緣＞2 cm且經(jīng)病理學(xué)檢查排除乳腺癌）石蠟標(biāo)本，按4 μm厚度連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，行微波抗原修復(fù)，室溫下加入3%H2O2反應(yīng)30 min，加入山羊血清封閉10 min，加入一抗鼠抗人PROX1單克隆抗體（貨號(hào)：ab33219，規(guī)格：0.2 mL，購(gòu)自上海羽朵生物科技有限公司，1∶200稀釋?zhuān)? ℃溫育過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（貨號(hào)：A0216，規(guī)格：100 μL，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，1∶50稀釋?zhuān)┒?，室溫反?yīng)30 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染，經(jīng)脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。以磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）替代一抗作為陰性對(duì)照，以已知陽(yáng)性玻片作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果判定：PROX1主要表達(dá)于細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜稍有染色，呈淡黃色或棕黃色顆粒狀彌散分布。高倍鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，采用半定量法［8］判定結(jié)果：

① 染色程度：0分為不染色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；② 陽(yáng)性細(xì)胞比例：0分為＜5%，1分為5%～25%，2分為26%～50%，3分為51%～75%，4分為＞75%；③ 根據(jù)前兩項(xiàng)評(píng)分乘積進(jìn)行判定：陰性（-）為0～2分；陽(yáng)性（+）為＞2分。

1.2.2 病例隨訪

所有患者術(shù)后均進(jìn)行隨訪，隨訪形式包括電話和門(mén)診復(fù)查。隨訪中，失訪4例，失訪率4.7%，以術(shù)后第1天作為隨訪起始時(shí)間，以患者死亡時(shí)間作為終點(diǎn)，即總生存期（overall survival，OS）。隨訪截止日期2018年3月31日，隨訪時(shí)間3～60個(gè)月，中位隨訪時(shí)間60個(gè)月，平均隨訪時(shí)間（48.22±17.41）個(gè)月。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用率值表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)，乳腺癌患者預(yù)后影響因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌和癌旁組織中PROX1蛋白水平

乳腺癌組織中PROX1蛋白陽(yáng)性率為71.76%，癌旁組織則為28.57%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=32.600，P＜0.001，圖1）。

圖 1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)乳腺癌和癌旁組織中PROX1蛋白表達(dá)Fig. 1 Expressions of PROX1 protein in breast cancer and adjacent tissues detected by immunohistochemistry

2.2 乳腺癌組織中PROX1蛋白在不同臨床病理指標(biāo)間的表達(dá)差異

乳腺癌組織中PROX1蛋白水平在不同年齡、腫瘤大小、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、HER2和分子分型患者之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而在不同分化程度、TNM分期、雌激素受體（estrogen receptor，ER）、Ki-67和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

表 1 乳腺癌組織中PROX1蛋白在不同臨床病理指標(biāo)間的表達(dá)差異性Tab. 1 Differential expressions of PROX1 protein in patients with different clinicopathological characteristics in breast cancer［n(%)］

2.3 乳腺癌組織中PROX1蛋白水平與患者預(yù)后的關(guān)系

PROX1陽(yáng)性表達(dá)組59例，死亡34例，5年總體生存率為42.37%；PROX1陰性表達(dá)組22例，死亡3例，5年總體生存率為86.36%，Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，PROX1陽(yáng)性組平均生存時(shí)間為（36.73±2.73）個(gè)月，PROX1陰性組則為（56.36±2.13）個(gè)月，Log-rank檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.803，P=0.001，圖2）。

2.4 影響乳腺癌患者預(yù)后的多因素分析

Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型結(jié)果顯示，分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和PROX1蛋白表達(dá)是影響乳腺癌患者預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素（P＜0.05，表2）。

圖 2 Kaplan-Meier法分析乳腺癌組織中PROX1蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系Fig. 2 The relationship between the expression of PROX1 protein in breast cancer and prognosis of patients was analyzed by Kaplan-Meier analysis

表 2 乳腺癌患者預(yù)后影響因素的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析Tab. 2 The prognostic factors of breast cancer patients were analyzed by Cox proportional hazard regression analysis

3 討 論

乳腺癌作為目前我國(guó)女性高發(fā)惡性腫瘤，發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，涉及多因素、多基因、多步驟、多環(huán)節(jié)。多項(xiàng)研究表明［9-11］，乳腺癌患者早期便可發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響患者疾病進(jìn)展及預(yù)后的主要因素。因此，深入探討與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)敏感基因或機(jī)制對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義。PROX1作為一種高度保守的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其基因位于人染色體1q32.2～32.3，在哺乳類(lèi)動(dòng)物淋巴管發(fā)育中發(fā)揮決定性作用，是胚胎發(fā)育中早期出現(xiàn)的淋巴分化標(biāo)志［12］，與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育、成熟等密切相關(guān)［13］，參與惡性腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程［14］，且與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、侵襲等關(guān)系密切［15］。Versmold等［16］研究指出，原發(fā)性乳腺癌組織中PROX1基因的CpG島甲基化顯著增加，且在原發(fā)性乳腺癌的腦轉(zhuǎn)移中亦觀察到頻繁的甲基化，PROX1可能成為在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性乳腺癌中高甲基化和轉(zhuǎn)錄沉默的新靶基因。張逸群等［17］指出，PROX1在乳腺癌組織中的高表達(dá)可能與乳腺癌淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中PROX1蛋白陽(yáng)性率高于癌旁組織，說(shuō)明PROX1蛋白在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，可能與乳腺癌發(fā)生密切相關(guān)。與臨床病理學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，低分化、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中PROX1蛋白呈高表達(dá)，說(shuō)明PROX1蛋白可能參與了乳腺癌惡性化過(guò)程。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，PROX1蛋白高表達(dá)與ER陽(yáng)性及Ki-67標(biāo)記指數(shù)低有關(guān)，我們推測(cè)PROX1蛋白表達(dá)可能通過(guò)影響ER活化及細(xì)胞增殖而參與乳腺癌進(jìn)展過(guò)程，但具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究明確。

有研究指出［18］，PROX1高表達(dá)與涎腺腺樣囊性癌預(yù)后差有關(guān)，可能是判斷涎腺腺樣囊性癌預(yù)后的潛在預(yù)測(cè)因子。本研究結(jié)果顯示，PROX1陽(yáng)性組5年OS率低于PROX1陰性組，且PROX1陽(yáng)性組平均生存時(shí)間短于PROX1陰性組，說(shuō)明PROX1蛋白水平與乳腺癌患者預(yù)后有關(guān)，PROX1陽(yáng)性表達(dá)可能是患者預(yù)后較差的預(yù)測(cè)指標(biāo)。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析結(jié)果顯示，PROX1蛋白水平是影響乳腺癌患者預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素，PROX1蛋白陽(yáng)性水平HR為4.319，進(jìn)一步說(shuō)明PROX1蛋白水平與乳腺癌患者預(yù)后有關(guān)，是影響患者預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素。

綜上所述，PROX1蛋白在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，且與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其陽(yáng)性表達(dá)與患者不良預(yù)后有關(guān)，是影響患者預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素，有望成為預(yù)測(cè)患者預(yù)后的因子及分子靶向治療的潛在靶點(diǎn)。