曹金玲，張 燁，張方淋，李大強，

1.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 200032；

2.復(fù)旦大學(xué)腫瘤研究所，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年增加，死亡率居女性惡性腫瘤的前列［1］。多聚ADP核糖聚合酶1［poly（ADP ribose）polymerase 1，PARP1］是核酶PARP家族表達最為豐富的一種亞型［2-3］，負責(zé)細胞內(nèi)90%的聚ADP核糖聚合體的形成，可以通過聚ADP核糖基化修飾各種核蛋白［3］。聚ADP核糖基化修飾在DNA損傷修復(fù)、染色質(zhì)重塑、基因轉(zhuǎn)錄以及調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等多種細胞生物學(xué)過程中扮演著重要的角色［2，4-5］。2014年P(guān)ARP抑制劑olaparib被批準(zhǔn)用于BRCA基因突變的卵巢癌治療，確定了其在癌癥治療中的臨床重要性，證實了PARP1可以作為癌癥治療的一個新靶點［6］。盡管PARP1是PARP蛋白家族中被廣泛研究的成員之一，但它的許多生物學(xué)特征仍未被發(fā)現(xiàn)［3］。

環(huán)指蛋白144A（ring finger protein 144A，RNF144A）是環(huán)指間環(huán)（ring-between-ring，RBR）E3泛素連接酶家族中一個成員，它的特點是具有3個重要的結(jié)構(gòu)域，包括RING1結(jié)構(gòu)域、IBR結(jié)構(gòu)域以及RING2結(jié)構(gòu)域［7-11］。迄今為止，RNF144A的生物學(xué)功能和作用機制尚不清楚。已有文獻報道RNF144A是DNA依賴性蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase，DNA-DPK）的E3泛素連接酶，可促進DNA損傷誘導(dǎo)的細胞凋亡［12］。本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn)，RNF144A是一種潛在的腫瘤抑制基因［13］，并且在乳腺癌細胞中RNF144A促進PARP1蛋白的泛素化修飾和降解，從而影響乳腺癌細胞對PARP抑制劑olaparib的敏感性［14］。但是，PARP1是否對RNF144A具有調(diào)節(jié)作用尚未見報道。

本課題將探究PARP1是否對RNF144A具有調(diào)節(jié)作用，以及這種調(diào)節(jié)作用對乳腺癌細胞凋亡的影響，為進一步探索PARP1對RNF144A調(diào)節(jié)作用的機制奠定基礎(chǔ)，為臨床上治療乳腺癌提供新的理論依據(jù)和治療思路。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

收集復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2017年1月—2017年6月經(jīng)外科手術(shù)切除、病理學(xué)檢查證實為Ⅰ～Ⅲ期乳腺癌患者標(biāo)本142例，患者均為女性，年齡為26～77歲，平均49.22歲。所有病例的臨床資料完整，術(shù)前均未進行任何放化療（表1）。本研究獲得復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

表 1 142例乳腺癌患者臨床病理特征Tab. 1 Clinicopathological features of 142 breast cancer patients

1.2 細胞培養(yǎng)與實驗試劑

人胚腎上皮細胞HEK-293T、人乳腺癌細胞MDA-MB-231、MCF-7、Hs578T均來自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫/中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心，PARP1小干擾RNA（small interference，siRNA）套裝購自上海華津生物科技有限公司，實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，AnnexinⅤ-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司，Neofect DNA轉(zhuǎn)染試劑購自上海騰易生物科技有限公司，PARP抑制劑olaparib購自美國Selleck公司。pCDH-HA-PARP1質(zhì)粒和pCDH-Flag-RNF144A質(zhì)粒見文獻報道［14］，pLVX-Flag-RNF144A質(zhì)粒由本實驗室自行構(gòu)建。兔抗人RNF144A多克隆抗體購自美國Lifespan公司（貨號：LS-C162648），鼠抗人PARP1單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司（貨號：sc-8007），小鼠抗人Vinculin單克隆抗體購自美國Sigma公司（貨號：V9131），山羊抗兔IgG二抗（貨號：7076V）和山羊抗小鼠IgG二抗（貨號：7074V）均購自美國Cell Signaling公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色

實驗操作按照免疫組織化學(xué)試劑盒說明書進行，用PBS代替一抗作為陰性對照。將乳腺癌組織切片先行抗原修復(fù)，加入PARP1一抗，4 ℃溫育過夜，加二抗37 ℃溫育30 min，加顯色劑顯色。上面每個步驟間均用PBS沖洗3次，每次3 min。然后采用蘇木精復(fù)染，脫水透明、封片、鏡下觀察。細胞核黃色著色細胞為陽性細胞。陽性判定按陽性細胞數(shù)及染色強度綜合分析。顯色細胞數(shù)＜10%計1分，11%～50%計2分，51%～80%計3分，大于80%計4分。染色強度：不著色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，褐黃色計3分。染色強度與細胞所占百分比的積分相乘，0分為陰性，1～4分為弱陽性，4～6分為中等陽性，大于6分為強陽性。

1.3.2 pCDH-HA-PARP1質(zhì)粒和pLVX-Flag-RNF144A質(zhì)粒慢病毒包裝

計數(shù)鋪HEK-293T細胞（1×107個/10 cm培養(yǎng)皿），第2天轉(zhuǎn)染目的質(zhì)粒。慢病毒包裝采用二質(zhì)粒系統(tǒng)，目的質(zhì)粒：包裝質(zhì)粒（pMD2.G和psPAX2）=1∶1，包裝質(zhì)粒pMD2.G∶包裝質(zhì)粒psPAX2=1∶3。轉(zhuǎn)染步驟參照Neofect DNA轉(zhuǎn)染試劑說明書。轉(zhuǎn)染48 h后收上清液，用0.45 μm的無菌濾膜過濾器過濾，過濾后的病毒上清液可以直接感染目的細胞，也可以分裝后保存在-80 ℃冰箱。

1.3.3 細胞全蛋白提取

棄去培養(yǎng)液，用1×PBS漂洗細胞兩次，棄凈。加入適量的含有蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑A、磷酸酶抑制劑B的RIPA裂解液，使細胞的表面能被裂解液均勻覆蓋，4 ℃搖床上裂解20 min，用刮子將細胞刮下后進行離心，14 000 r/min，4 ℃，離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的Eppendof試管中，然后用BCA法定量。蛋白樣品定量配制完成后在100 ℃的金屬浴中煮5 min，離心混勻即可。

1.3.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測

按照十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠的配方制備合適濃度的 SDS-PAGE凝膠膠板。將制備好的SDSPAGE膠板安裝好，加入電泳緩沖液，將蛋白樣品取合適的體積加入到凝膠內(nèi)的上樣孔中，90 V電壓電泳，電泳完畢后開始轉(zhuǎn)膜，用甲醇激活PVDF 膜，準(zhǔn)備4張濾紙，分別在轉(zhuǎn)膜夾板兩側(cè)覆蓋上一張海綿及兩張濾紙，將PVDF膜、PAGE凝膠放在轉(zhuǎn)膜夾板的濾紙上夾好，按照電源的正負放入轉(zhuǎn)膜槽內(nèi)，90 V轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢后，根據(jù)目的條帶大小切膜，晾干，甲醇激活，采用5%的牛血清白蛋白室溫封閉 1 h。加入一抗RNF144A（1∶1 000稀釋)、PARP1（1∶1 000稀釋）以及Vinculin（1∶10 000稀釋），4 ℃搖床上溫育過夜。第2天用1×PBST洗膜3次，每次10 min，加入對應(yīng)于一抗種屬來源的HRP標(biāo)記的二抗（山羊抗兔IgG二抗和山羊抗小鼠IgG二抗均為1∶5 000稀釋），在室溫搖床上溫育1～2 h，用1×PBST洗膜3次，每次10 min，然后曝光成像。

1.3.5 RTFQ-PCR檢測

按照TRIzol法提取細胞RNA，然后按照寶生物工程（大連）有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用10 μL體系，包括4 μL模板（cDNA稀釋5倍），1 μL前引物和后引物混合物（前引物和后引物混合物濃度為2 μmol/L），5 μL 2×SYBGREEN Mix，3個復(fù)孔。采用PCR儀器完成RTFQ-PCR后進行數(shù)據(jù)處理，其中使用的引物見表2。

表 2 RTFQ-PCR使用的引物信息Tab. 2 Primer sequences for RTFQ-PCR analysis

1.3.6 AnnexinⅤ-PE/7-AAD雙染法流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡的功能恢復(fù)實驗

計數(shù)鋪MCF-7細胞，第2天密度匯合至50%，按照設(shè)計好的實驗，用慢病毒表達空載體、HA-PARP1和HA-PARP1+Flag-RNF144A感染MCF-7細胞，10 cm培養(yǎng)皿加培養(yǎng)基6 mL，慢病毒加3 mL（慢病毒HA-PARP1∶慢病毒Flag-RNF144A=1∶1），加Polybrene（終質(zhì)量濃度為6 μg/mL）提高慢病毒對細胞的感染效率，24 h后加PARP抑制劑olaparib（終濃度20 μmol/L）誘導(dǎo)細胞凋亡，對照組加DMSO試劑處理。加藥24 h后收集細胞，按照AnnexinⅤ-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒（貨號：40310ES60）說明書處理細胞，處理好的細胞采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗中所有的數(shù)據(jù)均以x±s表示，兩個樣本間比較均使用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PARP1表達水平與乳腺癌患者的預(yù)后有關(guān)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示PARP1染色陽性主要為細胞核黃色著色。圖1A顯示PARP1在乳腺癌組織中不同的染色強度，PARP1高表達（強陽性、中等強度陽性、弱陽性）97例，PARP1低表達（陰性）45例。采用Kaplan-Meier方法分析兩者總生存和無復(fù)發(fā)生存情況，經(jīng)Log-rank檢驗分析發(fā)現(xiàn)PARP1高表達的乳腺癌患者總生存率（P=0.043）與無病生存率（P=0.034）較低。這些結(jié)果表明PARP1表達水平與乳腺癌患者的預(yù)后相關(guān)，PARP1在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能扮演著癌基因的角色（圖1）。

2.2 過表達PARP1下調(diào)RNF144A蛋白表達水平

在共轉(zhuǎn)染RNF144A和PARP1的HEK-293T細胞中，隨著PARP1的逐漸增加，RNF144A的蛋白表達量逐漸下降，說明在HEK-293T細胞中PARP1在蛋白水平負向調(diào)控RNF144A。我們又在HEK-293T、MCF-7中瞬時過表達PARP1，采用Western blot檢測RNF144A的蛋白表達。結(jié)果顯示過表達PARP1后，RNF144A的蛋白水平降低（圖2）。

2.3 敲低PARP1增加RNF144A蛋白表達水平但對其mRNA表達水平?jīng)]有影響

為了進一步確定細胞中PARP1對RNF144A的調(diào)節(jié)作用，我們在乳腺癌細胞MCF-7中，利用短發(fā)夾RNA（shRNA）干擾PARP1的表達，在MCF-7、Hs578T和HEK-293T中用siRNA敲低PARP1，然后用Westrn blot檢測RNF144A的蛋白表達。結(jié)果顯示，在PARP1敲低的情況下，RNF144A的蛋白表達水平明顯上升。為了檢測PARP1是否影響RNF144A轉(zhuǎn)錄水平，我們在敲低了PARP1的MCF-7、Hs578T和HEK-293T共3株細胞中，采用RTFQ-PCR檢測了RNF144A的mRNA表達水平。結(jié)果顯示，敲低PARP1對RNF144A mRNA水平?jīng)]有明顯影響（圖3）。這些結(jié)果說明PARP1在蛋白水平而非轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)RNF144A。

圖 1 免疫組織化學(xué)染色PARP1表達水平與乳腺癌患者生存率的相關(guān)性分析Fig. 1 The analysis of correlation between PARP1 expression level and survival rate of breast cancer patients by immunohistochemistry

圖 2 Western blot 檢測過表達PARP1對RNF144A蛋白表達水平的影響Fig. 2 The effects of PARP1 overexpression on protein expression levels of RNF144A detected by Western blot

2.4 PARP1通過調(diào)節(jié)RNF144A抑制MCF-7細胞的凋亡

為了探討PARP1調(diào)節(jié)RNF144A對乳腺癌細胞凋亡的影響，我們在MCF-7細胞中瞬時共轉(zhuǎn)染空載體、HA-PARP1和HA-PARP1+Flag-RNF144A，24 h后加20 μmol/L的PARP抑制劑olaparib誘導(dǎo)細胞凋亡。采用流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示在DMSO處理組空載體、HA-PARP1和HA-PARP1+Flag-RNF144A表達細胞的凋亡率（早期凋亡+晚期凋亡，下同）分別為（8.1±0.5）%、（5.4±0.1）%和（6.8±0.3）%。經(jīng)olaparib處理24 h后空載體、HA-PARP1和HA-PARP1+Flag-RNF144A表達細胞的凋亡率分別為（19.35±0.5）%、（13.25±0.45）%和（16.3±0.9）%。在DMSO以及olaparib處理組，與表達空載體的細胞相比，過表達PARP1后細胞凋亡率有所下降，但在過表達PARP1的細胞里重新過表達RNF144A后，凋亡率有一定程度的恢復(fù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4）。這些結(jié)果表明RNF144A在一定程度上能解除PARP1對乳腺癌細胞的凋亡抑制作用，因此我們推測PARP1通過調(diào)節(jié)RNF144A抑制乳腺癌細胞的凋亡。

圖 3 Western blot和RTFQ-PCR分析敲低PARP1對RNF144A蛋白與mRNA表達水平的影響Fig. 3 The effects of PARP1 knockdown on protein and mRNA expression levels of RNF144A detected by Western blot and RTFQ-PCR

圖 4 Annexin Ⅴ-PE/7-AAD雙染法流式細胞術(shù)檢測MCF-7細胞凋亡Fig. 4 Flow cytometry analysis of apoptosis of MCF-7 cells using Annexin Ⅴ-PE/7-AAD double staining

3 討 論

乳腺癌是一種具有較高異質(zhì)性的腫瘤［15］，根據(jù)不同的分子分型治療方法不盡相同。盡管我們在乳腺癌治療方面的研究取得了很大的進展，乳腺癌仍然是女性癌癥死亡的主要原因［16］。

PARP1和RNF144A在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和凋亡調(diào)控等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。Diamantopoulos等［17］的研究顯示，PARP1在DNA損傷時通過與DNA損傷部位結(jié)合，招募修復(fù)酶，修復(fù)DNA損傷，但如果損傷嚴重，它可能通過半胱天冬酶活化導(dǎo)致細胞凋亡。Ho等［18］的研究顯示，當(dāng)細胞遭受持續(xù)或嚴重的DNA損傷時，RNF144A通過誘導(dǎo)DNA-DPK泛素化降解參與p53介導(dǎo)的細胞凋亡。目前PARP1對RNF144A的調(diào)節(jié)作用還鮮見報道。蛋白質(zhì)豐度的直接影響因素包括相應(yīng)蛋白質(zhì)對應(yīng)的mRNA豐度、蛋白質(zhì)合成速率和降解速率。通過敲低和過表達PARP1后，檢測RNF144A蛋白和mRNA水平后發(fā)現(xiàn)PARP1從蛋白水平上調(diào)控RNF144A，而對其轉(zhuǎn)錄水平無影響。關(guān)于PARP1對E3泛素連接酶的調(diào)節(jié)作用機制，Zhou等［19］的研究表明，端錨聚合酶（PARP的一種）可以聚ADP核糖基化E3泛素連接酶RNF146，隨后泛素化聚ADP核糖基化的 RNF146，導(dǎo)致RNF146經(jīng)26s蛋白酶體途徑降解［19］。本文探討了PARP1在蛋白水平上對RNF144A有調(diào)節(jié)作用，但其調(diào)控機制還需進一步探討。

癌癥的一個重要特征是對細胞凋亡具有固有或獲得性抵抗［20］。目前越來越多的研究者認為藥物的療效與其誘導(dǎo)細胞凋亡的能力有關(guān)。腫瘤細胞對治療的反應(yīng)是發(fā)生凋亡并在體液循環(huán)中釋放細胞成分。因此，這些成分可以作為評估治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物，但是介紹這種方法的文獻資料很少，還需要大規(guī)模的前瞻性研究來驗證這種方法并更充分地闡明其臨床用途［15］。我們的免疫組化和Kaplan-Meier分析說明PARP1表達水平高與乳腺癌患者生存率有關(guān)，因此PARP1對RNF144A的調(diào)節(jié)作用可能與患者預(yù)后有直接的臨床相關(guān)性。AnnexinⅤ-PE/7-AAD雙染法流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡功能恢復(fù)實驗結(jié)果顯示，RNF144A能解除PARP1對小分子抑制劑olaparib誘導(dǎo)的細胞凋亡的抑制作用。細胞凋亡的目的在于清除受損細胞，此功能障礙會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［21］。因此，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡是抗癌治療中的重要環(huán)節(jié)。

本研究顯示PARP1通過調(diào)節(jié)RNF144A抑制乳腺癌細胞的凋亡，過表達RNF144A能解除PARP1對olaparib誘導(dǎo)的細胞凋亡的抑制作用，本研究結(jié)果對乳腺癌患者預(yù)后、乳腺癌細胞凋亡耐藥、化療藥及腫瘤小分子抑制劑的療效的研究均具有臨床指導(dǎo)意義，可望為乳腺癌的分子靶向治療提供新的線索。