張 能，蘇 鵬，陳書練，李曉光，黃 翔，羅 旭

遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科，貴州 遵義 563003

前列腺癌發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是患者致死的首要原因［1-2］，5年生存率僅為28%［3］。并且，我國大多數(shù)前列腺癌患者就診時(shí)已屬于晚期［4］的現(xiàn)狀造成療效及預(yù)后差。因此，對(duì)相應(yīng)關(guān)鍵蛋白的深入研究有重要的臨床價(jià)值。鋅指蛋白ZIC2在口腔鱗癌［5］、卵巢癌［6］及鼻咽癌［7］中均明顯上調(diào)，預(yù)示預(yù)后不良，并發(fā)揮癌基因作用。在肝癌干細(xì)胞中ZIC2高表達(dá)，能促進(jìn)肝癌干細(xì)胞自我更新，ZIC2下調(diào)后通過抑制OCT4表達(dá)而降低干細(xì)胞成球能力、裸鼠移植瘤生長［8］。因此，ZIC2在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中均具有重要的調(diào)控作用。

本文通過檢測(cè)前列腺癌組織中ZIC2的表達(dá)，探討ZIC2異常表達(dá)與前列腺癌病理參數(shù)間的關(guān)系，明確ZIC2的臨床價(jià)值；沉默前列腺癌中ZIC2基因后觀察其對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

回顧性檢測(cè)2015年1月—2018年1月遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科行前列腺穿刺活檢確診為前列腺癌組織，共31例?；颊吣挲g55～70歲（平均65.6±3.7歲）；術(shù)前檢測(cè)前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen，PSA）分布如下：＜10 mg/L 4例，10～20 mg/L 17例，＞20 mg/L 10例；病理學(xué)檢查Gleason評(píng)分：≤6分3例，7分21例，≥8分7例；臨床分期≤T2a5例，T2b14例，≥T2c12例。以同期行經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)（transurethral resection of the prostate，TURP）治療的35例良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）組織作為對(duì)照組。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibco公司，新生小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，DMSO購自美國Sigma公司，兔抗人ZIC2單克隆抗體（PA5-38538）購自美國Thermo Fisher Scientific公司，PBS、SP試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)胞與慢病毒載體

人前列腺癌細(xì)胞系DU145購自武漢博士德生物工程有限公司。含有效ZIC2基因干擾片段的慢病毒載體PSE2609由上海生博醫(yī)學(xué)生物工程科技有限公司構(gòu)建。

1.4 前列腺癌組織中ZIC2蛋白檢測(cè)

免疫組織化學(xué)SP兩步法檢測(cè)ZIC2蛋白水平。制作5 μm厚組織切片后根據(jù)試劑盒說明書完成免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)步驟：常規(guī)脫蠟水化，經(jīng)微波抗原修復(fù)后使用過氧化氫（H2O2）滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗3次后用山羊血清封閉。滴加一抗（ZIC2為1∶100），4 ℃冰箱過夜，用PBS反復(fù)沖洗3次后滴加二抗37 ℃溫育30 min，DAB顯色蒸餾水終止反應(yīng)，經(jīng)蘇木精復(fù)染后，樹脂封片后顯微鏡下觀察。陰性一抗對(duì)照用PBS緩沖液代替，以檢測(cè)細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野，對(duì)ZIC2蛋白陽性染色情況進(jìn)行評(píng)判，＜10%的腫瘤細(xì)胞染色為（+），10%～40%為（2+），40%～70%為（3+），＞70%為（4+）。用Image-proplus 6.0圖像分析軟件測(cè)量積分光密度（D）值進(jìn)行相對(duì)定量分析，總體陽性率判斷標(biāo)準(zhǔn)以染色細(xì)胞10%～40%（2+）為陽性；染色細(xì)胞＜10%為陰性。ZIC2蛋白在前列腺癌組織細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中呈陽性表達(dá)，大部分細(xì)胞核呈棕黃色。

1.5 前列腺癌細(xì)胞系培養(yǎng)

人前列腺癌細(xì)胞系DU145培養(yǎng)于含10%新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，每隔2 d更換新鮮培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長至80%～90%，0.1%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，按 1∶4～1∶2傳代。

1.6 含ZIC2干擾片段慢病毒載體的合成及細(xì)胞轉(zhuǎn)染

設(shè)計(jì)并篩選兩條ZIC2干擾片段靶點(diǎn)：序列1為5'-TGCACATGAAGGAGCACCCGGATTA-3'；序列2為5'-CATGAAGGAG CACCCGGATTATAAA-3'。兩條干擾片段的干擾效果前期預(yù)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)驗(yàn)證，均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)中選擇了序列1作為研究材料。由上海生博醫(yī)學(xué)生物工程科技有限公司構(gòu)建含有效ZIC2干擾片段的慢病毒載體PSE2609。按照慢病毒轉(zhuǎn)染操作手冊(cè)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞系DU145并培養(yǎng)，對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞經(jīng)0.1%胰酶消化取0.5×105個(gè)接種于24孔板內(nèi)，待融合度到50%后按慢病毒復(fù)染指數(shù)（multiplicity of infection，MOl）100進(jìn)行轉(zhuǎn)染，即每孔轉(zhuǎn)染病毒數(shù)5×106個(gè)，常規(guī)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)ZIC2蛋白水平變化。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡

收集DU145及DU145-RNAi細(xì)胞，800 r/min離心5 min去除培養(yǎng)液。用PBS清洗3遍后重懸計(jì)數(shù)，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/mL，依次加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC、5 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI），混勻、避光放置15 min。用0.9%NaCl溶液再次重懸后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡情況。采用四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，細(xì)胞生長周期需用4 ℃預(yù)冷的75%酒精重懸過夜后再送流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)（proliferation index，PI）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

資料采用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間陽性率的檢驗(yàn)采用χ2檢驗(yàn)完成，臨床病理參數(shù)及細(xì)胞周期與凋亡間差異比較采用行×列表χ2檢驗(yàn)，配對(duì)資料采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

PSA、Gleason分值及臨床分期是前列腺癌危險(xiǎn)度的關(guān)鍵臨床病理參數(shù)［9］。本研究檢測(cè)前列腺癌中ZIC2并探討其表達(dá)情況與PSA、Gleason分值及臨床分期的可能關(guān)系。

2.1 ZIC2蛋白在前列腺癌及BPH組織中的水平

本研究中ZIC2蛋白在前列腺癌組織中的陽性表達(dá)率為（以++為陽性標(biāo)準(zhǔn)）90.32%（28/31），其中（4+）為12例，（3+）為11例，（2+）為5例，（+）為2例，（-）為1例；明顯高于BPH組織中表達(dá)率20%（7/35），其中（4+）為1例，（3+）為2例，（2+）為4例，（+）為12例，（-）為16例。兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=32.639，P=0.000，表1和圖1）。

表 1 ZIC2在前列腺癌組織及BPH中總體陽性表達(dá)情況Tab. 1 Overall positive expression of ZIC2 in prostate cancer and BPH tissue

圖 1 前列腺癌及BPH組織中ZIC2蛋白表達(dá)免疫組織化學(xué)結(jié)果Fig. 1 ZIC2 protein level was detected by immunohistochemistry in prostate cancer and BPH tissue (SP, ×100)

2.2 前列腺癌中ZIC2蛋白水平變化與前列腺癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

31例前列腺癌組織中ZIC2蛋白呈陽性表達(dá)為28例，總體陽性表達(dá)率為90.32%（28/31）。ZIC2陽性表達(dá)數(shù)量在不同PSA中的分布情況分別是：＜10 mg/L 3例，10～20 mg/L 16例，＞20 mg/L 9例，ZIC2在不同PSA分級(jí)中進(jìn)行分析，結(jié)果表明ZIC2陽性表達(dá)率與PSA高低差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.888；P=0.527）；ZIC2陽性表達(dá)數(shù)量在不同Gleason分值中的分布情況分別是：≤6分 2例，7分 20例，≥8分6例，ZIC2及在不同Gleason分值中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示ZIC2蛋白與Gleason分級(jí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.753，P=0.003）；ZIC2陽性表達(dá)數(shù)量在不同臨床分期中的分布情況分別是：≤T2a期3例，T2b期13例，≥T2c期12例，ZIC2在不同臨床分期中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.837，P=0.060，表2）。

表 2 ZIC2蛋白在前列腺癌中的表達(dá)情況及臨床病理參數(shù)的相關(guān)程度Tab. 2 Relationship between the expression of ZIC2 and clinical and pathological parameters in prostate cancer tissue

2.3 前列腺癌細(xì)胞中ZIC2基因干擾后其蛋白水平變化

Western blot檢測(cè)受干擾前后前列腺癌細(xì)胞中ZIC2蛋白變化情況。經(jīng)過siRNA處理后前列腺癌細(xì)胞DU145中ZIC2表達(dá)明顯降低，與親代細(xì)胞DU145相比較ZIC2蛋白表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

圖 2 干擾前后ZIC2蛋白在前列腺癌細(xì)胞DU145中變化情況Fig. 2 Expression levels of ZIC2 protein in prostate cancer cell DU145 before and after interference

2.4 前列腺癌細(xì)胞中ZIC2低表達(dá)后細(xì)胞增殖、凋亡的變化

圖 3 MTT法分析ZIC2基因受干擾后前列腺癌細(xì)胞DU145增殖情況Fig. 3 The proliferation rate of DU145 prostate cancer cells interfered by ZIC2 gene detected by MTT analysis

本研究使用siRNA降低前列腺癌細(xì)胞中ZIC2的表達(dá)水平，明確ZIC2對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染含有ZIC2基因干擾片段后前列腺癌的增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡均發(fā)生改變。采用MTT檢測(cè)親代前列腺癌細(xì)胞DU145及ZIC2在siRNA作用后DU145（DU145-RNAi）中細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示ZIC2表達(dá)降低后前列腺癌細(xì)胞增殖速度顯著減慢；與DU145相比，48、72及96 h細(xì)胞的增殖情況差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3）。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡。與DU145相比較，DU145-RNAi 細(xì)胞中G1及G2期細(xì)胞增殖比率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3及圖4）。S期細(xì)胞增殖比率增加（27.64±1.51）% vs（39.43±2.95）%（t=4.362，P=0.012）；ZIC2低表達(dá)的細(xì)胞系DU145總凋亡率明顯增加，與親本細(xì)胞系DU145相比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5及表3）。

表 3 ZIC2低表達(dá)后前列腺癌細(xì)胞周期變化及凋亡比較Tab. 3 Comparison of cell cycle and apoptosis after downregulation of ZIC2 in prostate cancer cells

圖 4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期顯示ZIC2受干擾后細(xì)胞周期發(fā)生改變Fig. 4 Cell cycle changes were detected by fl ow cytometry after ZIC2 interference

圖 5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ZIC2干擾后細(xì)胞凋亡變化Fig. 5 Changes in apoptosis after ZIC2 interference were detected by fl ow cytometry

3 討 論

前列腺癌是歐美等國家男性最常見的惡性腫瘤，來自美國國立癌癥研究所（National Cancer Institute，NCI）的數(shù)據(jù)顯示前列腺癌的死亡率僅次于肺癌，成為第二位致死性惡性腫瘤［10］。近12年來我國前列腺癌的發(fā)病率年增速為4.7%，死亡率年增速為5.5%［11］?；颊哐錚SA、Gleason評(píng)分和臨床分期是前列腺癌危險(xiǎn)等級(jí)公認(rèn)的三個(gè)核心指標(biāo)。隨著對(duì)前列腺癌的深入研究，探討前列腺癌相關(guān)的其他蛋白對(duì)該疾病的診斷和治療有重要的臨床意義，其可能成為潛在靶點(diǎn)。

ZIC2是鋅指蛋白家族重要的成員之一，在結(jié)構(gòu)上包含高度保守、串聯(lián)的C2H2鋅指樣結(jié)構(gòu)［12］。ZIC2對(duì)脊椎動(dòng)物神經(jīng)發(fā)育發(fā)揮著重要的作用，參與神經(jīng)管和神經(jīng)嵴的形成［13］。人和小鼠胎兒發(fā)育過程中，若ZIC2基因發(fā)生突變將導(dǎo)致前腦無裂畸形［14］。小鼠和斑馬魚神經(jīng)嵴形成過程中ZIC2發(fā)揮重要作用［15］。在許多腫瘤中發(fā)現(xiàn)ZIC2異常表達(dá)，并發(fā)揮癌基因作用［5，16-17］?？谇击[狀細(xì)胞癌和卵巢癌中，ZIC2表達(dá)均明顯上調(diào)，并且與不良預(yù)后密切相關(guān)［5，16］；鼻咽癌中ZIC2表達(dá)顯著增加，其啟動(dòng)子與HOXA10功能區(qū)結(jié)合后促進(jìn)表達(dá)導(dǎo)致腫瘤增殖及侵襲能力增強(qiáng)［7］；ZIC2表達(dá)下調(diào)能明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的存活率［8］；宮頸癌中ZIC2表達(dá)也明顯升高，下調(diào)ZIC2表達(dá)會(huì)通過抑制Hedgehog信號(hào)通路中Gli1表達(dá)降低Hedgehog信號(hào)通路活性，最終抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和軟瓊脂中克隆形成能力［6］；ZIC2在胰腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，下調(diào)ZIC2則會(huì)通過抑制FGFR3和ANXA8的表達(dá)阻滯細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［17］。Zhu等［16］研究表明，ZIC2在肝癌干細(xì)胞中高表達(dá)，并且可以促進(jìn)肝癌干細(xì)胞的自我更新，ZIC2下調(diào)后會(huì)通過抑制OCT4的表達(dá)降低干細(xì)胞成球能力和裸鼠體內(nèi)成瘤性。因此，ZIC2在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中均具有重要的調(diào)控作用。

本研究結(jié)果顯示，31例前列腺癌組織中ZIC2蛋白呈陽性表達(dá)為28例，總體陽性率為90.32%（28/31），明顯高于BPH組織中表達(dá)率為20%（7/35），二者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=32.639，P=0.000）。其中ZIC2陽性表達(dá)數(shù)量在不同PSA分級(jí)中的分布情況分別是：＜10 mg/L 3例，10～20 mg/L 16例，＞20 mg/L 9例，ZIC2在不同PSA分級(jí)中進(jìn)行分析，結(jié)果表明ZIC2陽性表達(dá)率與PSA分級(jí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.888；P=0.527）；ZIC2陽性表達(dá)數(shù)量在不同Gleason分級(jí)中的分布情況分別是：≤6分2例，7分20例，≥8分6例，ZIC2在不同Gleason分級(jí)中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示ZIC2蛋白與Gleason分級(jí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.753，P=0.003）；根據(jù)此結(jié)果，我們推測(cè)前列腺癌中ZIC2的表達(dá)與Gleason分級(jí)越高的細(xì)胞形態(tài)學(xué)異型性不斷升高甚至出現(xiàn)前列腺癌干細(xì)胞數(shù)量增加有關(guān)，具體關(guān)系需在干細(xì)胞的分子水平進(jìn)一步探討Gleason分值與ZIC2表達(dá)量間相關(guān)性，ZIC2可能成為與Gleason評(píng)分一樣具有重要臨床價(jià)值的危險(xiǎn)因素。ZIC2陽性表達(dá)數(shù)量在不同臨床分期中分別是：≤T2a期3例，T2b期12例，≥T2c期13例，ZIC2在不同臨床分期中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.837，P=0.060），目前ZIC2陽性表達(dá)與臨床分期之間無相關(guān)（P=0.060），我們考慮可能與以下因素相關(guān)：本次為納入T3期以上的患者資料，并且在T2期分期中總的陽性病例數(shù)28例，再分為3個(gè)亞組后統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)值與ZIC2臨床標(biāo)本中的實(shí)際表達(dá)存在偏差，為明確ZIC2的表達(dá)情況需進(jìn)一步增加病例數(shù)量及優(yōu)化分層進(jìn)行比較。

通過對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞中ZIC2蛋白檢測(cè)顯示，親代前列腺癌細(xì)胞DU145中ZIC2蛋白呈高表達(dá)，ZIC2基因受干擾后的DU145中ZIC2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下降，結(jié)合文獻(xiàn)及結(jié)果提示ZIC2在前列腺癌起癌基因的作用，并且干擾處理后達(dá)到預(yù)期效果。既往研究顯示ZIC2表達(dá)降低后導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲能力降低［8］及抑制卵巢癌細(xì)胞的存活率［6］。本文通過MTT法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖及凋亡情況。MTT法結(jié)果顯示ZIC2表達(dá)降低后前列腺癌細(xì)胞增殖速度顯著減慢；與DU145相比，48、72及96 h細(xì)胞的增殖差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；ZIC2基因低表達(dá)后細(xì)胞周期發(fā)生明顯變化（表3及圖4），與對(duì)照組DU145相比較G1期及G2期細(xì)胞增殖比率明顯降低，而S期細(xì)胞增殖比率增加［（27.64±1.51）% vs（39.43±2.95）%］。MTT及細(xì)胞周期分析結(jié)果提示ZIC2表達(dá)降低后能夠有效抑制細(xì)胞的增殖，并使細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)化。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡結(jié)果顯示，ZIC2低表達(dá)細(xì)胞株DU145的晚期凋亡率及總凋亡率明顯增高；與親代細(xì)胞DU145相比，晚期凋亡及總凋亡率，分別為（5.76±0.66）%及（24.78±2.15）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究顯示ZIC2在前列腺癌中高表達(dá)，屬癌基因，且與前列腺癌Gleason評(píng)分密切相關(guān)；表達(dá)降低后能明確改變前列腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡。結(jié)果提示ZIC2可能是前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的重要調(diào)節(jié)因子，但其中的機(jī)制，特別是與相關(guān)信號(hào)通路間的相互作用，值得進(jìn)行深入研究。