李園園李清林尹誠語臺燕劉伯宇胡奇妙項璇兒鄭小莉劉伯一方劍喬

1.浙江中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院 杭州 310053 2.浙江省腫瘤醫(yī)院3.浙江中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥科學研究院

隨著全球惡性腫瘤發(fā)病率的不斷上升，抗腫瘤藥物的臨床應用日益增多。如紫杉醇（paclitaxel,PTX），作為臨床常用的化療藥物，從紅豆杉中提取，通過促進細胞內微管蛋白聚合保持其穩(wěn)定，進而抑制腫瘤細胞增殖[1]，廣泛應用于實體瘤如乳腺癌、卵巢癌和非小細胞肺癌的化學治療[2]。化療誘導的周圍神經(jīng)痛是化療藥物最常見的不良反應。紫杉醇等化療藥物誘發(fā)的周圍神經(jīng)病變（chemotherapy-induced peripheral neuropathy，CIPN）表現(xiàn)為手足疼痛感或麻木等癥狀，對鎮(zhèn)痛藥具有抵抗力，是一種難治性痛癥[3]。由于對其機制缺乏深入研究，目前尚無療效顯著的治療措施。因此，尋找能有效干預紫杉醇誘發(fā) CIPN的方法并闡明其機理，是現(xiàn)在急切需要解決的問題。

瞬時感受器電位香草酸受體1型（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）屬于瞬時受體電位（transient receptor potential，TRP） 離子通道家族的瞬時感受器電位香草酸受體（transient receptor potential vanilloid，TRPV）家族，主要在中、小直徑背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）神經(jīng)元中表達[4-5]，是一類與疼痛密切相關的離子通道，是生理病理性疼痛的關鍵因素[6-7]。有研究報道，在外周神經(jīng)損傷模型[8-9]中，如紫杉醇誘發(fā)的CIPN大鼠模型，大鼠DRG神經(jīng)元中TRPV1的表達上調[10-12]。應用TRPV1拮抗劑、華蟾素等可通過抑制大鼠DRG中TRPV1的過表達逆轉紫杉醇誘導的機械痛過敏[11-12]。

電針（electroacupuncture，EA）是目前公認的有效控制疼痛的重要手段之一，具有副作用小、價格便宜、臨床易于推廣的優(yōu)點，廣泛應用于各類急慢性疼痛的治療。實驗研究證明低頻電針可抑制TRPV1的活化，并且對于周圍神經(jīng)痛具有較優(yōu)鎮(zhèn)痛效應[14-16]，如紫杉醇誘發(fā)CIPN[17-18]，但其機制是否與干預DRG中TRPV1過表達有關，目前尚未有明確報道。本實驗擬通過建立紫杉醇誘導的周圍神經(jīng)痛大鼠模型，觀察造模后大鼠右足足底機械縮足反應閾值（paw withdrawal thresholds，PWTs）的變化。采用電針干預及免疫熒光方法，通過觀察低頻電針對紫杉醇誘發(fā) CIPN大鼠模型疼痛行為學變化以及對 DRG中 TRPV1表達的干預作用，探討低頻電針治療紫杉醇誘發(fā)大鼠 CIPN的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠42只，體質量200～220g，購自中國科學院上海實驗動物中心，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)，許可證號：SCX（滬）2008-0016。飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動物標準顆粒飼料（由實驗動物中心提供）及自由飲水，12h循環(huán)燈光，室溫（23±2）℃。實驗過程中對動物的處置符合2006年科技部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 主要試劑及儀器 藥用級紫杉醇（安素泰，澳大利亞），兔抗大鼠Anti-VR1多克隆抗體（美國Abcam，產品貨號：ab6166），驢抗兔 IgG H&L（美國 Abcam，產品貨號：ab150061），其余試劑均為市售分析純級。纖毛機械刺激針（von Frey Hairs test觸覺纖維絲，美國 stoelting），韓式穴位神經(jīng)刺激儀（型號：HANS-200A，聯(lián)創(chuàng)科技南京濟生醫(yī)療科技有限公司），全能臺式高速冷凍離心機（型號：Sorvall Biofuge Stratos，美國 Thermo Scientific公司），Thermo冰凍切片機（型號：HM550，美國 Thermo Scientific公司），激光共聚焦顯微鏡（型號：NiKON Elements AR，日本Nikon公司）。

1.3 方法

1.3.1 分組 用于建立模型的14只大鼠完全隨機分為2組：溶劑組、紫杉醇組，每組7只；用于研究電針干預紫杉醇誘發(fā) CIPN及 TRPV1通道表達的28只大鼠完全隨機分為溶劑組、紫杉醇組、紫杉醇+電針組、紫杉醇+假電針組，每組7只。

1.3.2 動物模型制備 參照已有學者成功制備大鼠紫杉醇誘導大鼠神經(jīng)病理痛模型的方法[19,20]，將藥物級紫杉醇用0.9%無菌鹽水從原液濃度6mg/ml稀釋至1mg/ml，并且以2mg/kg的劑量每隔1天腹腔（i.p.）給藥，共進行 4 次注射（第 1、3、5、7d），達到最終累積劑量為8mg/kg，建立 CIPN模型。溶劑組僅接受等量無菌生理鹽水。

1.3.3 治療干預 溶劑組、紫杉醇組不做任何電針處理。紫杉醇+電針組：第10d，介入電針干預，選取雙側“足三里”和“昆侖”穴（參照華興邦大鼠穴位圖譜）[21]，采用0.18mm×13mm毫針，進針后連接“LH-200A韓氏穴位暨神經(jīng)刺激儀”，治療參數(shù)：波形為連續(xù)波，頻率 2Hz，強度 0.5～1.5mA（開始 0.5mA，每 10min 增加0.5mA），共 30min，1次/d，至實驗結束。紫杉醇+假電針組：選穴及干預時間同電針組，進針至皮下不超過2mm深度，連接“LH-200A韓氏穴位暨神經(jīng)刺激儀”，不開機，持續(xù)30 min，1次/d，至實驗結束。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 PWTs檢測 參照參考文獻[22]，第一部分于大鼠第 0、2、4、6、8、15 和 22d 時間點 PWTs 作為痛閾指標；第二部分于大鼠第 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18d時間點PWTs作為痛閾指標。測量前，先將大鼠置于鐵絲網(wǎng)上透明有機玻璃罩（20cm×20cm×15cm）內，適應環(huán)境30min。待其安靜后，選取0.4、0.6、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0、26.0 g 總計 11 種強度的von Frey絲，最先使用4.0g強度的von Frey絲進行檢測。von Frey絲對準大鼠右側后足足底（避開足墊），緩慢上抬von Frey絲，至纖維絲彎曲成S形，連續(xù)刺激5s。如大鼠未產生逃避反應，記為“O”并換取高一個強度的纖維絲刺激，直至大鼠產生逃避反應。如大鼠產生逃避反應，記為“X”并換取低一個強度的纖維絲刺激，直至大鼠不產生逃避反應。連續(xù)進行6次測量，每次刺激間最小間隔2min。記錄大鼠一系列反應。按如下公式進行痛閾計算：50%PWTs(g)=10^（xf+κ*δ-4）。公式中各值含義為：Xf代表最后一次測量的von Fery絲強度，κ值代表up and down法中陽性（X）/陰性（O）反應參數(shù)表內參考值，查表后獲得，δ為各個強度 von Frey絲力度取對數(shù)后差值的平均值，在此約等于0.185。設定最大刺激強度26g，最小刺激強度為0.4g。若計算得出50%PWTs大于26.0g或小于0.4g，仍以26.0g或0.4g作為最大或最小值。行為學測量時間固定在9:00-16:00，環(huán)境溫度：23±2℃。

1.4.2 取材及樣本處理 第一部分實驗于第22d；第二部分實驗于第18d，完成痛閾測量后，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，注射劑量為0.35ml/100g。開胸暴露心臟，經(jīng)升主動脈快速灌注4℃生理鹽水，快速推注4%多聚甲醛約150ml，再予4%多聚甲醛緩慢滴注15min左右，待大鼠肢體僵硬，快速取出L4-6 DRG，放入含有4%多聚甲醛的 EP管內，固定3h，依次置于15%（24h，沉底）、30%（48h，沉底）蔗糖溶液脫水，液氮速凍，-80℃保存。

1.4.3 免疫熒光染色 用冷凍切片機進行冷凍冠狀位連續(xù)切片，采用貼片法，切片厚度10μm,每6個層次取1張切片，每只大鼠一個節(jié)段DRG切取10張玻片，隨機取4張熒光圖片進行熒光統(tǒng)計。切片滴加5%正常山羊血清 37℃封閉1h，滴加一抗（兔抗大鼠TRPV1 ab6166，1:400）4℃孵育過夜，滴加二抗（驢抗兔 ab150061，1:600）37℃避光孵育 1h，滴加抗熒光淬滅封片液（美國Abcam,產品貨號:ab104139），蓋玻片封片。激光掃描共焦熒光顯微鏡下觀察并攝片用Nikon Elements AR Analysis軟件（Nikon公司）進行陽性細胞及直徑大小的計數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所有資料采用±s表示。兩組間比較采用獨立樣本Student’s t檢驗，多組間比較采用重復測量方差分析和單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較，方差齊性時采用最小顯著性差異法（Least—Significant Difference，LSD）檢驗，方差不齊時采用 Dunnett’s T3檢驗，均以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 紫杉醇對大鼠50%PWTs的影響 如圖1A所示進行模型建立和實驗觀察。如圖1B所示，紫杉醇溶液注射前，各組大鼠 50%PWTs比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。造模后1d，與溶劑組相比，紫杉醇組大鼠50%PWTs下降（P＜0.01），并且隨著時間的推移持續(xù)下降到第21d（P＜0.01）。而溶劑組大鼠閾值保持穩(wěn)定沒有下降。圖1C所示曲線下面積也顯示紫杉醇造模后，兩組大鼠出現(xiàn)顯著差異（P＜0.01）。以上結果說明紫杉醇誘導周圍神經(jīng)痛模型造模成功。

2.2 紫杉醇對大鼠 L4-6 DRG神經(jīng)元TRPV1表達的影響 如圖2A及2B所示，造模后，紫杉醇組大鼠右側L4-6 DRG中TRPV1表達陽性神經(jīng)元個數(shù)相比溶劑組出現(xiàn)增多現(xiàn)象。圖2B為圖2A細胞個數(shù)統(tǒng)計圖，統(tǒng)計后數(shù)據(jù)顯示，與溶劑組相比，紫杉醇組大鼠右側L4-6 DRG中TRPV1表達陽性神經(jīng)元個數(shù)顯著增多（P＜0.01）。圖2C表明紫杉醇組增多的TRPV1陽性表達神經(jīng)元主要集中于中、小直徑 DRG神經(jīng)元。

2.3 電針對紫杉醇誘發(fā)大鼠CIPN的干預作用 如圖3A所示，進行模型建立和實驗觀察。圖3B顯示造模前各組大鼠50%PWTs比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。圖3B顯示造模后，與溶劑組相比，紫杉醇組、紫杉醇+電針組、紫杉醇+假電針組50%PWTs顯著下降（均P＜0.01）。電針干預后，與紫杉醇+假電針組相比，紫杉醇+電針組50%PWTs上調（P＜0.01）。紫杉醇+假電針組50%PWTs與紫杉醇組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。圖3C所示的曲線下面積統(tǒng)計圖與圖3B結論一致。

2.4 低頻電針對紫杉醇誘發(fā)CIPN大鼠L4-6 DRG神經(jīng)元TRPV1過表達現(xiàn)象的干預作用 如圖4A所示，電針干預后，紫杉醇組大鼠右側L4-6 DRG中TRPV1陽性表達細胞較溶劑組增多；紫杉醇+電針組大鼠右側L4-6 DRG中TRPV1陽性表達細胞較紫杉醇+假電針組、紫杉醇組減少；圖4B為4A統(tǒng)計圖，與溶劑組相比，紫杉醇組大鼠右側L4-6 DRG中TRPV1陽性表達細胞顯著增多（P＜0.01）。與紫杉醇組+假電針組相比，紫杉醇+電針組大鼠右側 L4-6 DRG中TRPV1陽性表達細胞顯著減少（P＜0.01）。而與紫杉醇組相比，紫杉醇+假電針組大鼠右側L4-6 DRG中TRPV1陽性表達細胞表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。圖4C表明電針可以顯著減少紫杉醇所導致的TRPV1在中小直徑 DRG神經(jīng)元中的過表達作用。

3 討論

圖1 紫杉醇對大鼠不同時間點50%PWTs的影響Fig.1 The effects of paclitaxel on 50%PWTs at different time points in rats

化療誘發(fā)的周圍神經(jīng)痛是抗癌治療中常見并發(fā)癥，其主要癥狀為感覺異常、麻木和疼痛，目前缺乏有效的預防和治療措施，嚴重影響患者的生活質量[23]。在所有化療藥物中，紫杉醇誘發(fā)周圍神經(jīng)病變的發(fā)病率為60%～70%[24]。本實驗結果顯示，隔天腹腔注射2mg/kg紫杉醇，紫杉醇組大鼠右側50%PWTs均顯著下降，且在整個實驗期間均維持在較低水平，與溶劑組相比差異具有統(tǒng)計學意義，表明成功建立大鼠周圍神經(jīng)痛模型。該結果與以往研究結果相一致[19,25]。

現(xiàn)代研究表明，電針對慢性痛具有良好的鎮(zhèn)痛效果[26-27]，而低頻電針不僅通過抑制TRPV1的活化治療神經(jīng)痛[15-16]，對紫杉醇誘發(fā)CIPN同樣具有治療作用[17-18]。本實驗結果顯示，造模后進行電針干預，紫杉醇+電針組大鼠的50%PWTs相對紫杉醇組明顯升高，且差異具有統(tǒng)計學意義。因此，表明低頻電針干預可降低紫杉醇誘發(fā)CIPN的機械痛痛覺過敏，這一結果與以往報道相一致[17-18]。

圖2 各組大鼠右側L4-6 DRG神經(jīng)元 TRPV1表達水平（免疫熒光，10x）（±sem）Fig.2 The expression of TRPV1 in L4-6 DRGs neurons in the right lumbar of each group(immunofluorescence,10x)

TRPV1是一種與疼痛密切相關的非選擇性陽離子通道，它同時參與了慢性痛外周敏化和疼痛中樞調制[28]。大量研究表明，TRPV1參與紫杉醇誘發(fā)CIPN的痛覺過敏[11,29]。以往研究表明，疼痛模型大鼠的小直徑DRG神經(jīng)元中TRPV1的表達增加[30]。本實驗發(fā)現(xiàn)，紫杉醇造模后18d及22d，紫杉醇大鼠右側DRG中TRPV1表達明顯高于溶劑組。免疫組織化學分析表明紫杉醇大鼠的中、小直徑DRG神經(jīng)元中TRPV1表達顯著增加。該結果提示，中、小直徑 DRG神經(jīng)元中TRPV1的上調可能介導紫杉醇誘發(fā)CIPN的機械痛痛覺過敏。本實驗發(fā)現(xiàn)紫杉醇+電針組大鼠右側DRG中TRPV1的表達明顯低于紫杉醇組、紫杉醇+假電針組。以上結果表明，低頻電針可有效抑制中、小直徑DRG神經(jīng)元TRPV1的過表達。以往研究表明抑制脊髓背角中TRPV1的活化可介導電針治療炎性痛和神經(jīng)病理痛[31]，但并不清楚抑制DRG中TRPV1的上調是否介導低頻電針治療CIPN以及電針是否通過其他通路調控 TRPV1的表達。已有研究表明TLR4參與紫杉醇誘發(fā)CIPN[32]，并可增強感覺神經(jīng)元中TRPV1的活化[33]，并在DRG神經(jīng)元中共定位，使用TLR4抑制劑，可降低DRG中TRPV1的過表達，并逆轉已經(jīng)出現(xiàn)的痛覺過敏[34-36]。因此，DRG中TLR4可能通過誘導TRPV1的高表達及活化進而參與調節(jié)紫杉醇誘發(fā)CIPN。

圖3 電針治療后，紫杉醇對大鼠不同時間點50%PWTs的影響Fig.3 The effects of 2Hz EA or Sham EA treatment on 50%PWTs of rat CIPN model

本研究從低頻電針干預CIPN的角度出發(fā)，深入探討了低頻電針對CIPN產生的干預作用的可能機制，通過觀察低頻電針對DRG中TRPV1過表達的干預作用，探索電針干預CIPN的外周神經(jīng)調節(jié)機制。綜上研究發(fā)現(xiàn)可知，低頻電針可以有效緩解CIPN，使50%PWTs升高，其作用機制可能與其下調中、小直徑DRG神經(jīng)元中TRPV1的過表達水平有關，但低頻電針是否通過TLR4-TRPV1通路干預紫杉醇誘發(fā)CIPN的深層次機制有待進一步研究，這一研究將有助于為針灸治療CIPN提供可能靶點，揭示低頻電針治療CIPN的機制，并為推動電針進一步應用于CIPN的臨床治療提供理論依據(jù)。

圖4 電針治療后，各組大鼠右側L4-6 DRG神經(jīng)元TRPV1表達水平變化（免疫熒光，10x）（±sem）Fig.4 Effect of 2Hz EA or Sham EA on expression of TRPV1 in L4-6 DRGs neurons in the right lumbar of each group(immunofluorescence,10x)