馬湘煒蔣淑敏趙筱萍

1.浙江中醫(yī)藥大學藥學院 杭州 310053 2.浙江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院

注射用血塞通（凍干）（簡稱血塞通，Xuesaitong injection，XST），是由五加科人參屬植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的根莖提取物經加工制成的凍干粉針劑，主要成分為三七總皂苷，臨床上主要用于腦梗死、心肌梗塞、動脈粥樣硬化等疾病的治療[1-3]。目前血塞通質量控制主要是采用指紋圖譜以及高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography,HPLC）含量檢測等方法[4-5]，但是單純的化學分析方法只能檢測主要化學成分的含量波動，與其生物活性的相關性較低，難以有效保障臨床安全性與有效性[6]。因此，有必要建立與血塞通藥效相關的生物活性檢測方法，從而綜合評價其穩(wěn)定性。

課題組前期研究表明，抗炎以及抗血小板聚集是血塞通抗大鼠腦缺血再灌注損傷的主要途徑[7]；基于網絡藥理學手段研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、一氧化氮合酶（induced NOS，iNOS）可能是血塞通抗大鼠心肌梗死的潛在靶點，進一步驗證發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1、三七皂苷R1、人參皂苷Rd 能夠顯著性下調脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激后RAW 264.7巨噬細胞iNOS蛋白表達[8]。因此，本研究以抗炎活性為指標，采用LPS刺激骨髓來源巨噬細胞向M1型極化，以M1型巨噬細胞為細胞模型，檢測不同批次血塞通對一氧化氮（nitric oxide，NO）以及炎性細胞因子白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、高遷移率族蛋白 B1（high mobility group box 1，HMGB1）分泌量的影響，通過比較正常批次與異常批次血塞通抗炎活性的差異，初步構建其生物活性評價標準，提供一種新的血塞通批次間一致性評價方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 無特定病原體（specific pathogen free,SPF）級 C57BL/6 小鼠，雌性，6～8 周，體質量 18～20g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司[動物許可證號碼：SCXK（滬）2017-0005]。

1.1.2 試劑與藥物 LPS、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購自美國Sigma公司（批號：043M4104V、STBH3607）,RPMI 1640 培養(yǎng)基、Penicillin Streptomycin雙抗購自美國Corning公司（批號：05118006、30002283），胎牛血清購自美國Gibco公司（批號：1914728），氯化銨溶液購自加拿大Stemcell Tech公司（批號：17H83563），重組小鼠巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor,M-CSF）購自美國PeproTech公司（批號：0817245）,三七皂苷R1、人參皂苷 Rg1、人參皂苷 Re、人參皂苷 Rb1、人參皂苷Rd購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司（批號：120821、150823、120723、120120、120507）, 無水乙醇購自上海凌峰化學試劑有限公司（批號：20181112）,一氧化氮檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司（批號：S0021）,小鼠HMGB1酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司（批號：L3L29SEKUA）,小鼠IL-6酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司（批號：193843003）,不同批次注射用血塞通（凍干）由哈爾濱珍寶制藥有限公司提供。

1.1.3 儀器 高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司，型號：Centrifuge5810/5810R）,Infinite M1000pro多功能酶標儀（瑞士Tecan公司，型號：M1000pro）,Count-Less自動細胞計數儀（美國Invitrogen公司，型號：10082-056）,細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司，型號：3111），超凈工作臺（美國Thermo公司，型號：1300 Series A2）。

1.1.4 血塞通異常批次制備 異常批次采用血塞通中5個主要單體化合物儲備液按一定含量比例配制而成。異常批次1～4中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Re按血塞通正常批次中單體含量比例（分別為10.85%、38.11%和5.16%）配制，人參皂苷Rb1及人參皂苷Rd的含量比例分別為：異常批次1不含人參皂苷Rb1及人參皂苷Rd；異常批次2人參皂苷Rb1含量為5%，人參皂苷Rd含量為0.5%；異常批次3人參皂苷Rb1含量為10%，人參皂苷Rd含量為1%；異常批次4人參皂苷Rb1含量為20%，人參皂苷Rd含量為2%。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠骨髓細胞的提取及骨髓來源巨噬細胞的誘導分化 取6～8周、18g左右的C57BL/6小鼠脫頸處死后浸泡在75%酒精中消毒，在無菌超凈工作臺內取出完整的小鼠股骨和脛骨，置于含RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內。用1mL注射器的針頭在股骨和脛骨兩端打孔并吹打骨髓腔，將其骨髓內的細胞沖至RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，收集于50mL離心管中，4℃，1500rpm離心10min。棄上清液，在細胞沉淀中加入氯化銨溶液裂解紅細胞1min，加入等量的RPMI-1640完全培養(yǎng)液，4℃，1500rpm離心10min，棄上清液。用含10ng·mL-1M-CSF的促分化RPMI-1640完全培養(yǎng)液重懸細胞，以8×106個/孔細胞密度種于12孔板，置于5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)，于第4天換液，第7天得到誘導成熟的骨髓來源巨噬細胞。

1.2.2 血塞通抗炎活性量效關系考察 從培養(yǎng)箱中取出含有成熟骨髓來源巨噬細胞的12孔板，棄去每孔培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（posphate buffered saline,PBS）漂洗一遍備用。實驗分為3組，分別為對照組、模型組以及給藥組。對照組加入1mL RPMI-1640完全培養(yǎng)液；模型組加入1mL含100ng·mL-1LPS的RPMI-1640完全培養(yǎng)液；給藥組加入1mL含不同濃度血塞通（400、300、200μg·mL-1） 及 100ng·mL-1LPS 的RPMI-1640完全培養(yǎng)液。置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，吸取每孔細胞上清液，離心后收集上清液用于檢測NO、IL-6以及 HMGB1含量。

抑制率（%）=（模型組含量-給藥組含量）/（模型組含量-對照組含量）×100%。

1.2.3 血塞通主要成分抗炎活性檢測 采用1.2.2的方法考察血塞通5個主要成分三七皂苷R1（200μmol·L-1）、人參皂苷Rg1（200μmol·L-1）、人參皂苷Re（200μmol·L-1）、人參皂苷Rb1（200μmol·L-1）、人參皂苷Rd（100μmol·L-1）對M1型巨噬細胞釋放NO、IL-6以及 HMGB1的抑制作用。

1.2.4 不同批次血塞通抗炎活性檢測 采用1.2.2的方法考察24個正常批次及4個異常批次血塞通（400μg·mL-1） 對 M1 型巨噬細胞釋放 NO、IL-6 以及HMGB1的抑制作用。

1.2.5 NO、IL-6及HMGB1含量的檢測方法 用RPMI-1640完全培養(yǎng)液稀釋1mol·L-1NaNO2標準品，選取 0、1、2、5、10、20、40、60、100μmol·L-1濃度作為標準曲線濃度梯度。吸取100μL/孔細胞上清液樣品及不同濃度標準品于96孔板中，每個樣品作三復孔。室溫避光條件下，各孔分別加入50μL Griess ReagentⅠ和50μL Griess ReagentⅡ，然后在540nm處測定吸光度。根據不同濃度標準品顯色后測得的吸光度為縱坐標，標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算不同樣品中NO含量。IL-6及HMGB1含量按照酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immune-sorbent assay，ELISA）試劑盒說明書所述方法進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法 實驗數據以均數±標準差(standard difference,SD)（mean±SD）表示，采用Graphpad Prism 7軟件進行數據處理及作圖，用T-Test檢驗分析，P＜0.05表示組間具有差異。采用Simca 14.1軟件繪制三維散點圖。所有實驗均重復3次。

2 結果

2.1 血塞通抗炎活性量效關系 與對照組相比，LPS刺激24h后模型組M1型巨噬細胞NO、IL-6以及HMGB1 分泌量顯著增加（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01），表明該模型可用于抗炎活性評價。見圖1。血塞通可抑制M1型巨噬細胞NO、IL-6以及HMGB1的分泌，且在200至400μg·mL-1濃度范圍內抑制率呈現(xiàn)劑量依賴性關系。見圖2。

圖1 M1型巨噬細胞NO、IL-6以及HMGB1的分泌量Fig.1 Secretions of NO,IL-6 and HMGB1 in M1 macrophages

圖2 不同濃度血塞通對M1型巨噬細胞NO、IL-6及HMGB1分泌的抑制作用Fig.2 Dose-dependent inhibitions of XST on the secretions of NO,IL-6 and HMGB1 in M1 macrophages

2.2 血塞通主要成分對M1型巨噬細胞NO、IL-6及HMGB1分泌的抑制作用 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷 Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd是血塞通主要成分。運用上述評價模型研究5個主要化合物的抗炎活性，結果表明人參皂苷Rb1及人參皂苷Rd具有較好的抗炎活性。其中，人參皂苷Rb1及人參皂苷Rd對M1型巨噬細胞NO及IL-6分泌具有較高的抑制作用，但對HMGB1分泌的抑制作用相對較弱。見圖3。

圖3 血塞通主要成分對M1型巨噬細胞NO、IL-6以及HMGB1分泌的抑制作用Fig.3 The inhibitions of major components in XST on the secretions of NO,IL-6 and HMGB1 in M1 macrophages

2.3 不同批次血塞通對M1型巨噬細胞NO、IL-6及HMGB1分泌的抑制作用 采用上述評價模型分別考察24個正常批次與4個異常批次血塞通樣品的抗炎活性。結果表明，其對炎性因子IL-6、HMGB1分泌的抑制作用具有明顯差異。其中，正常批次對NO、IL-6及HMGB1抑制率平均值分別為（75.47±7.68）%、（78.34±8.07）%、（45.84±8.45）%，異常批次對 NO、IL-6及HMGB1抑制率平均值分別為（31.87±18.15）%、（16.06±11.99）%、（-9.24±3.90）%。見表 1。結合多指標三維散點圖發(fā)現(xiàn)，正常批次與異常批次具有較明顯區(qū)分，且正常批次分布較為密集，而異常批次分布相對比較散亂。見圖4。

圖4 正常及異常批次血塞通的多指標評價Fig.4 The evaluation of normal and abnormal batches of XST by multi-indicators

表1 24個正常批次與4個異常批次血塞通對M1型巨噬細胞NO、IL-6及HMGB1分泌的抑制率（±s，%）Tab.1 The inhibitions rates of 24 normal batches and 4 abnormal batches of XST on the secretions of NO,IL-6 and HMGB1 in M1 macrophages（±s，%）

表1 24個正常批次與4個異常批次血塞通對M1型巨噬細胞NO、IL-6及HMGB1分泌的抑制率（±s，%）Tab.1 The inhibitions rates of 24 normal batches and 4 abnormal batches of XST on the secretions of NO,IL-6 and HMGB1 in M1 macrophages（±s，%）

批次正常批次異常批次批號 抑制率（%）NO IL-6 HMGB1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 1 2 3 4 86.67±6.66 82.03±3.79 70.34±8.34 73.38±4.62 83.03±4.78 80.61±12.51 76.48±10.15 73.31±6.02 76.65±5.09 80.00±1.27 75.20±1.05 67.59±8.87 69.08±6.54 75.43±4.50 85.27±5.78 69.61±9.32 85.03±3.79 86.41±2.43 76.17±10.10 78.98±7.66 66.26±15.49 74.16±18.18 62.04±15.52 57.49±20.47 20.92±10.50 12.93±17.98 41.22±4.16 52.41±15.03 85.03±9.36 90.40±8.82 80.97±3.28 87.64±11.96 88.80±4.17 78.95±4.10 74.48±4.15 74.26±9.43 72.64±12.52 81.20±4.74 74.17±13.84 70.84±13.14 61.75±19.27 85.88±8.66 81.30±9.84 76.17±10.80 88.24±26.92 88.82±18.21 65.73±16.07 78.33±9.73 67.29±17.60 82.75±3.91 76.09±14.00 68.45±11.41 4.30±18.25 8.63±17.84 20.44±17.28 30.84±11.87 58.94±14.06 60.56±6.43 52.11±10.53 46.38±8.67 48.37±13.67 47.34±10.96 47.98±1.82 50.55±14.20 43.38±14.19 46.05±7.79 41.65±12.38 39.05±13.81 52.51±26.40 47.78±15.27 53.34±10.95 42.58±8.29 36.57±31.04 46.18±6.18 51.50±4.24 51.82±6.63 29.55±8.99 43.87±13.25 39.27±11.50 22.85±14.06-13.28±17.98-11.63±15.31-7.20±15.86-4.84±15.17

2.4 血塞通批次間一致性的生物活性評價標準研究為了建立血塞通生物活性評價標準，通過計算24個正常批次在不同抗炎活性指標下抑制率的均值和標準差，繪制生物活性控制限圖。由圖可知，正常批次與異常批次NO、IL-6、HMGB1抑制率存在顯著差異（P＜0.01）。以均值加減3倍標準差評判血塞通正常樣品批次間一致性，發(fā)現(xiàn)正常批次全部符合標準，而異常批次均超出標準的控制限。由此，初步確定血塞通抗炎活性評價標準，采用小鼠骨髓來源M1型巨噬細胞模型，和血塞通樣品孵育24h后檢測NO、IL-6以及HMGB1的分泌量，反映抗炎活性的3個指標抑制率的控制限分別為52.42%～98.52%、54.14%～102.54%及20.49%～71.20%。見圖5。

3 討論

生物評價方法具有與中藥藥理作用、臨床功效相關聯(lián)等優(yōu)點，已逐漸成為中藥質量控制及評價的重要發(fā)展方向之一[9]。目前已有研究者采用生物檢測方法建立少數幾個中成藥品種的生物評價方法，例如血栓通膠囊抑制血小板聚集活性檢測[10]，大黃配方顆粒致瀉生物效價檢測[11]，丹紅注射液抗氧化損傷能力檢測[12]等方法。但目前血塞通生物評價方法尚未有文獻報道。據此，本研究基于血塞通抗炎活性檢測，建立一種多指標的生物評價方法。

圖5 血塞通一致性評價的生物活性控制限圖Fig.5 Bioactivity control chart for batch-to-batch consistency evaluation of XST

本研究提取小鼠骨髓細胞，在M-CSF誘導下形成成熟的骨髓來源巨噬細胞，使用LPS刺激骨髓來源巨噬細胞向M1型極化，產生炎癥反應。骨髓來源的巨噬細胞，雖然操作復雜，但相比細胞株更接近體內生長特性，更適宜用于藥物的生物活性評價。研究表明巨噬細胞受LPS刺激后分泌TNF-α、IL-6等促炎性因子以及炎癥介質iNOS等[13]。iNOS是NOS的同工酶，被激活后能產生大量的NO，作為炎癥發(fā)生的重要標志[14]。IL-6是關鍵的促炎細胞因子，在炎癥初始階段合成后，快速誘導廣泛的急性期蛋白產生[15-16]。HMGB1是一種非組蛋白核蛋白，與炎癥性疾病如膿毒癥、關節(jié)炎以及由炎癥誘發(fā)的相關疾病如動脈粥樣硬化等密切相關[17-19]。炎癥反應是腦梗和心肌梗死重要的病理過程，研究表明腦梗和心肌梗死患者血清中NO、IL-6、HMGB1含量增加[20-24]。因此本研究選擇NO、IL-6、HMGB1這3個經典的炎癥指標，用于血塞通抗炎生物評價。

結果表明，血塞通能夠劑量依賴性地降低M1型巨噬細胞NO、IL-6以及HMGB1的分泌量，其中血塞通對NO及IL-6的抑制率明顯高于HMGB1。三七皂苷 R1、人參皂苷 Rg1、人參皂苷 Re、人參皂苷 Rb1、人參皂苷Rd是血塞通主要成分，占總含量的85%以上。這5個成分的抗炎活性檢測結果表明人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd是血塞通抗炎主要活性物質。人參皂苷Rb1及人參皂苷Rd對M1型巨噬細胞NO、IL-6分泌具有較強的抑制作用，但對HMGB1抑制率相對較弱，這可能是引起血塞通對HMGB1抑制作用較弱的原因。為進一步探究上述檢測方法能否有效區(qū)分血塞通正常批次與異常批次，本研究通過調整5個主要成分的比例，配置了人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd含量比例異常的樣品，模擬血塞通生產過程波動產生的異常批次。4個異常批次中，人參皂苷Rb1及人參皂苷Rd含量比例分別為20%/2%、10%/1%、5%/0.5%及0%/0%，顯著低于血塞通藥品標準中規(guī)定的含量比例（人參皂苷Rb1含量應為標示量的26%～40%、人參皂苷Rd應為標示量的3.5%～12%）。將24個正常批次及4個異常批次血塞通進行抗炎活性檢測，發(fā)現(xiàn)正常批次抑制率平均值遠高于異常批次，表明正常批次與異常批次血塞通對M1型巨噬細胞NO、IL-6、HMGB1分泌的抑制作用均具有明顯差異。為更加全面評價不同批次血塞通抗炎活性，采用多指標對正常及異常批次進行比較，結果顯示多指標評價對血塞通正常批次及異常批次具有非常直觀的區(qū)分效果。

為建立血塞通生物活性評價標準，以均值±3倍標準差作為上下限繪制生物活性控制限圖，以評價不同批次間的一致性和差異性[25]，結果顯示24個正常批次血塞通均位于控制限內，異常批次均超出控制限范圍，進一步證明了方法的可靠性。

本研究提供了一種基于多指標抗炎活性檢測的血塞通批次間一致性評價新方法，建立了與臨床療效相關聯(lián)的血塞通生物評價方法，初步建立了血塞通抗炎活性評價標準，為血塞通批次間一致性評價提供了新途徑。