張 園 任 卓 侯建玲 鄭榮濤 李中偉劉建新 龐 靜 黃 娜 田洪青1,

梅毒是由梅毒螺旋體(Treponemapallidum，Tp)感染所致的一種性傳播疾病，危害極大，可侵犯全身各組織器官或通過(guò)胎盤傳播引起死產(chǎn)、流產(chǎn)、早產(chǎn)和胎傳梅毒。據(jù)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā)布數(shù)據(jù)，近十年來(lái)梅毒居乙類傳染病發(fā)病數(shù)前3位，梅毒受到廣泛關(guān)注。梅毒螺旋體長(zhǎng)期以來(lái)無(wú)法成功連續(xù)體外培養(yǎng)，很大程度上限制了對(duì)梅毒的研究。雖然目前有關(guān)于梅毒螺旋體長(zhǎng)期體外培養(yǎng)的文章報(bào)道[1]，但是過(guò)程復(fù)雜。另一方面，通過(guò)對(duì)梅毒螺旋體全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)不同地域不同菌株之間存在一定差異，此差異是否影響發(fā)病機(jī)制尚未清楚[2]。同時(shí)，梅毒研究多基于臨床Nichols標(biāo)準(zhǔn)株[3,4]，由于地域差別，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)株的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足對(duì)當(dāng)?shù)孛范镜恼J(rèn)知。因此，建立并研究當(dāng)?shù)孛范韭菪w臨床菌株感染動(dòng)物模型具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭雄兔購(gòu)于濟(jì)南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心，體重2.5～3.5 kg，年齡4個(gè)月左右，取血清行梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)(TPPA)、梅毒甲苯胺紅不加熱血清血清試驗(yàn)(TRUST)檢測(cè)以排除兔梅毒螺旋體感染，預(yù)先飼養(yǎng)1周使其適應(yīng)環(huán)境，并予不含有抗生素的飼料、水喂養(yǎng)。

1.1.2 菌株 采自山東省皮膚病醫(yī)院門診疑似或確診梅毒的患者。取其皮損分泌物，共收集6例菌株。詢問(wèn)病史，患者自述發(fā)病前均有不潔性交史，發(fā)病前后無(wú)抗生素服用史。其中，患者A、D的TRUST滴度較高，而Tp-PCR陰性，可能原因?yàn)榕R床標(biāo)本Tp含量低，或Tp-PCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程中Tp-DNA提取不充分?；颊逨已在外院確診梅毒，拒絕行Tp-PCR檢測(cè)。基本臨床信息見(jiàn)表1。本研究通過(guò)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

表1 患者基本臨床信息

注：“-”為陰性，“N”未行Tp-PCR檢測(cè)

1.1.3 試劑 戊巴比妥鈉(山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心惠贈(zèng))，0.9%生理鹽水，正常兔血清(NRS)(自制)，梅毒螺旋體抗體檢測(cè)(TPPA)試劑盒(凝集法)(FUJIREBIO INC)，梅毒甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)(TRUST)診斷試劑(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司)，梅毒螺旋體(Tp)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢測(cè)試劑盒(廣州達(dá)安基因生物科技有限公司)。

1.1.4 儀器及相關(guān)器材 2mL及5mL注射器，漩渦混合器，兔固定箱，解剖臺(tái)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀ABI7500/7300，生物安全柜，兩套無(wú)菌手術(shù)刀、手術(shù)剪、組織鑷、止血鉗，培養(yǎng)皿，酒精棉球，離心管，離心機(jī)，凍存管。

1.2 方法

1.2.1 臨床菌株分離 患者充分暴露皮損，無(wú)菌棉簽清潔梅毒患者皮損，拭子棉簽刮取皮損滲液。每位患者取三個(gè)拭子，一個(gè)用于Tp-PCR檢測(cè)，另兩個(gè)用于兔睪丸接種。

1.2.2 菌懸液制備 分別向兩個(gè)拭子管內(nèi)加入800 μL 0.9%生理鹽水，室溫震蕩3 min，洗脫拭子棉簽中梅毒螺旋體，將含菌生理鹽水轉(zhuǎn)入1.5 mL無(wú)菌離心管中，加入200 μL NRS，制備為20%NRS菌懸液，4℃保存。

1.2.3 接種 將新西蘭兔置于兔盒中，按30 mg/kg 3%戊巴比妥鈉行耳緣靜脈注射麻醉，待充分麻醉，將其固定于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作臺(tái)。按壓下腹部充分暴露兔睪丸，消毒睪丸及其周圍皮膚，先后取兩只注射器各吸取1～1.2 mL菌懸液分別注入兩側(cè)睪丸內(nèi)。接種過(guò)程中固定睪丸以防回縮，注射器針頭應(yīng)插入睪丸中間位置，防止菌懸液注入陰囊內(nèi)。當(dāng)接種凍存的菌株時(shí)，需解凍至室溫，以免凍傷兔睪丸。

1.2.4 傳代 待兔血清學(xué)檢測(cè)TPPA陽(yáng)性，兔睪丸出現(xiàn)腫脹變硬時(shí)，90 mg/kg 3%戊巴比妥鈉靜脈注射處死感染梅毒模型兔，將兩側(cè)睪丸分離置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，快速轉(zhuǎn)移至無(wú)菌安全柜內(nèi)。無(wú)菌手術(shù)刀及手術(shù)剪將睪丸切碎，移入無(wú)菌離心管內(nèi)。向離心管中加入10 mL 50% NRS(NRS與0.9%生理鹽水混合)。震蕩10 min，300×g水平離心7 min。吸取菌懸液置于無(wú)菌離心管，再接種。實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作，符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理，實(shí)驗(yàn)人員做好自我防護(hù)。

1.2.5 保存 取2 mL無(wú)菌凍存管，加入1 mL 50% NRS菌懸液，再加入1 mL 100%無(wú)菌甘油，將菌懸液與甘油輕輕吹打混勻，置于-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 計(jì)數(shù) 吸取50 μL菌懸液，按照梅毒螺旋體(Tp)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，對(duì)菌懸液進(jìn)行定性定量分析。

1.2.7 臨床觀察與血清學(xué)檢測(cè) 接種第3天后，每隔3天觀察、觸診睪丸變化。每隔7天抽血檢測(cè)TPPA、TRUST。

2 結(jié)果

2.1 原代兔梅毒模型 采集6株臨床梅毒螺旋體，接種成功5株，即A、C、D、E、F株。B株兔模型于接種后因缺氧第2天死亡，可能由于麻醉期間誤吸所致。A、 C、D、E、F菌株分別于接種后第28天、7天、14天、32天、35天TPPA轉(zhuǎn)陽(yáng)，A菌株梅毒兔模型一側(cè)睪丸腫大(圖1)，C、D菌株梅毒兔模型雙側(cè)睪丸均發(fā)現(xiàn)腫大，D菌株兔模型一側(cè)陰囊出現(xiàn)潰瘍(圖2)。A、C、D菌株分別于接種后第49天、88天、105天處死感染兔，切除睪丸，制備菌懸液，取50 μL菌懸液行PCR熒光檢測(cè)，A、C、D分別計(jì)數(shù)為8.87×106、1.03×105、1.03×103，結(jié)果匯總見(jiàn)表2。

2.2 傳代兔梅毒模型 對(duì)A菌株傳代，兔于接種后平均6天出現(xiàn)睪丸腫脹，血清學(xué)TPPA轉(zhuǎn)陽(yáng)平均時(shí)間為接種后7.7天，睪丸平均分離時(shí)間為接種后13.3天，取第一、二、三代50 μL菌懸液行PCR熒光檢測(cè)計(jì)數(shù)分別為2.63×106、1.22×104、5.38×104，見(jiàn)表3。三代感染兔均出現(xiàn)睪丸腫脹，未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)腫大、眼損傷等臨床癥狀。

圖1 A菌株兔模型左側(cè)睪丸腫大

圖2 D菌株兔雙側(cè)睪丸腫大，左側(cè)陰囊見(jiàn)一潰瘍損害

菌接種時(shí)間TPPA轉(zhuǎn)陽(yáng)時(shí)間(d)分離時(shí)間(d)Tp-PCRA201803012849天8.87×106C20180813788天1.03×105D2018082714105天1.03×103E2018120732--F2019012135--

注:未對(duì)E、F菌株分離

表3 A菌株原代與傳代梅毒兔模型睪丸炎

注：*為弱陽(yáng)性

2.3 冷凍菌株兔梅毒模型 第二代菌株凍存55天后接種于兔睪丸，第12天出現(xiàn)睪丸腫脹，第14天TPPA陽(yáng)性，第39天TRUST陽(yáng)性，滴度為1∶4。

3 討論

梅毒螺旋體體外培養(yǎng)困難，建立合適的動(dòng)物模型是研究梅毒的重要方法。研究發(fā)現(xiàn)，Tp可在猿猴、白鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠、家兔體內(nèi)繁殖[5]。經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)表明，家兔是最理想的梅毒研究動(dòng)物模型，現(xiàn)已用于明確接種后各階段梅毒兔的病理生理及相關(guān)影響因素的變化，對(duì)梅毒發(fā)病機(jī)制、診斷方法、藥物治療及預(yù)后等多方面重要意義[6]。

梅毒感染模型建立受眾多因素影響，主要包括菌株因素、宿主因素、實(shí)驗(yàn)條件因素及實(shí)驗(yàn)方法因素。首先為菌株因素，其包括菌株類型、來(lái)源及含菌量。大量研究已證實(shí)Nichols株適應(yīng)兔睪丸內(nèi)生長(zhǎng)，而其他菌株較難適應(yīng)兔睪丸內(nèi)生長(zhǎng)增殖[7]。不同類型菌株，其毒力不同。Nichol菌株毒力較大，1～2個(gè)Tp即可引起睪丸炎發(fā)生。如同樣接種100萬(wàn)Tp，Nichols菌株和Gand菌株的持續(xù)時(shí)間分別為6～8天、39天[8]。另外，菌株來(lái)源廣泛，如梅毒患者血液、皮損分泌物、腦脊液、皮損組織等，Gayet-Ageron等[9]對(duì)Tp-PCR的敏感性及特異性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)一期梅毒患者硬下疳分泌物和先天梅毒新生兒血液中敏感性最高。Tong等[10]對(duì)梅毒兔感染試驗(yàn)(RIT)進(jìn)行再評(píng)估，結(jié)果顯示一期患者皮損分泌物比神經(jīng)梅毒腦脊液的RIT陽(yáng)性率高，且腦脊液感染所需時(shí)間更長(zhǎng)，同時(shí)作者對(duì)樣本分析發(fā)現(xiàn)服用抗生素治療后的臨床樣本RIT陽(yáng)性率較低。最新研究表明，一期、二期梅毒患者全血中Tp-DNA較潛伏梅毒高，且檢出率與患者RPR滴度有相關(guān)性[11]?？梢?jiàn)，一期、二期梅毒患者更容易取到Tp。冷凍菌株感染性較弱，但可能由于菌株保存過(guò)程中菌活力降低，所以發(fā)病期延長(zhǎng)[12]。1925年，Chesney等[13]實(shí)驗(yàn)顯示接種菌量主要影響潛伏期和持續(xù)時(shí)間，即菌量越多，潛伏期越短，而對(duì)疾病發(fā)展無(wú)明顯影響,接種最少致病菌量，同樣可使產(chǎn)生明顯的損害。

其次為宿主，即兔及實(shí)驗(yàn)條件因素。1923年，Chesney等[14]探究了兔性別與年齡對(duì)梅毒兔模型的影響，發(fā)現(xiàn)年齡小于6個(gè)月且睪丸成熟的雄兔對(duì)Tp反應(yīng)更加明顯，所以推薦選用睪丸成熟且年齡小的雄兔作為梅毒兔模型。接種前后，兔需無(wú)抗生素食物喂養(yǎng)，當(dāng)體內(nèi)含有抗生素時(shí)，菌株侵襲力降低。因Tp對(duì)較高溫度不耐受，當(dāng)接種后皮膚溫度20℃以上時(shí)，皮損較輕，孵育期較長(zhǎng)，說(shuō)明低溫有利于Tp的增殖，大量實(shí)驗(yàn)證明飼養(yǎng)溫度保持18℃～20℃有利于Tp生長(zhǎng)及兔皮損形成。在夏季，盡管嚴(yán)格控制溫度，Tp生長(zhǎng)和皮損形成缺乏穩(wěn)定性，可能由于兔體內(nèi)激素發(fā)生變化[7]。新西蘭兔實(shí)驗(yàn)前應(yīng)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)至少飼養(yǎng)一周，使其熟悉適應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件，有助于減少不良反應(yīng)甚至死亡發(fā)生。接種前有必要禁飲食，以防麻醉時(shí)發(fā)生胃內(nèi)容物反流而誤吸引起吸入性肺炎致命。接種后，應(yīng)密切觀察飲食、身體變化等，當(dāng)實(shí)驗(yàn)前后飲食量及身體變化較大時(shí)，應(yīng)分析原因，做好準(zhǔn)備措施，以預(yù)防兔死亡。同一菌株A接種于不同新西蘭兔，TPPA轉(zhuǎn)陽(yáng)時(shí)間及臨床改變不盡相同，推測(cè)可能由于兔自身的免疫功能差異所決定。接種Tp同時(shí)注射激素，可增加皮損內(nèi)Tp數(shù)量，有助于皮損形成[15]。

梅毒兔模型的構(gòu)建，不僅受菌株因素、兔及實(shí)驗(yàn)條件的影響，另外實(shí)驗(yàn)方法同樣重要。Tp抵抗力極弱，對(duì)熱及干燥均特別敏感。血液中4℃放置72～120 h后死亡[16]，56℃加熱5 min死亡或離體后干燥1～2 h即死亡，對(duì)常用化學(xué)消毒劑敏感，10～29 g/L石碳酸內(nèi)數(shù)分鐘死亡體外存活時(shí)間較短，所以需要在菌株分離、收集后的1 h內(nèi)完成接種，這就要求實(shí)驗(yàn)前應(yīng)準(zhǔn)備好試劑、器材，獲取Tp后快速接種，以免錯(cuò)過(guò)最佳存活時(shí)機(jī)，從而影響菌株的增殖。制備菌懸液時(shí)，可加入10%～50%正常兔血清延長(zhǎng)Tp體外存活時(shí)間。雖有文獻(xiàn)報(bào)道Tp可體外存活數(shù)小時(shí)，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)降低接種成活率，所以推薦盡快接種。Tp傳代方法很多，如皮內(nèi)、靜脈、顱內(nèi)注射，依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇接種方式，但傳統(tǒng)以睪丸內(nèi)注射為主。Chesney等[14]通過(guò)睪丸接種與皮內(nèi)接種進(jìn)行比較探究了兩者對(duì)梅毒兔模型的影響，結(jié)果顯示睪丸內(nèi)接種的兔出現(xiàn)早期反應(yīng)更加劇烈，全身?yè)p害的比率更高。國(guó)內(nèi)研究者對(duì)睪丸內(nèi)注射方法和皮下注射方法進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)前者TPPA、RPR轉(zhuǎn)陽(yáng)時(shí)間較早，RPR滴度較高，臨床癥狀發(fā)生率高[17]。