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        臨床梅毒螺旋體菌株兔感染模型構(gòu)建

        2019-06-01 03:31:16侯建玲鄭榮濤李中偉劉建新田洪青1
        中國麻風(fēng)皮膚病雜志 2019年5期
        關(guān)鍵詞:螺旋體梅毒懸液

        張 園 任 卓 侯建玲 鄭榮濤 李中偉劉建新 龐 靜 黃 娜 田洪青1,

        梅毒是由梅毒螺旋體(Treponemapallidum,Tp)感染所致的一種性傳播疾病,危害極大,可侵犯全身各組織器官或通過胎盤傳播引起死產(chǎn)、流產(chǎn)、早產(chǎn)和胎傳梅毒。據(jù)國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā)布數(shù)據(jù),近十年來梅毒居乙類傳染病發(fā)病數(shù)前3位,梅毒受到廣泛關(guān)注。梅毒螺旋體長期以來無法成功連續(xù)體外培養(yǎng),很大程度上限制了對(duì)梅毒的研究。雖然目前有關(guān)于梅毒螺旋體長期體外培養(yǎng)的文章報(bào)道[1],但是過程復(fù)雜。另一方面,通過對(duì)梅毒螺旋體全基因組測序發(fā)現(xiàn)不同地域不同菌株之間存在一定差異,此差異是否影響發(fā)病機(jī)制尚未清楚[2]。同時(shí),梅毒研究多基于臨床Nichols標(biāo)準(zhǔn)株[3,4],由于地域差別,對(duì)標(biāo)準(zhǔn)株的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足對(duì)當(dāng)?shù)孛范镜恼J(rèn)知。因此,建立并研究當(dāng)?shù)孛范韭菪w臨床菌株感染動(dòng)物模型具有重要意義。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭雄兔購于濟(jì)南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心,體重2.5~3.5 kg,年齡4個(gè)月左右,取血清行梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)(TPPA)、梅毒甲苯胺紅不加熱血清血清試驗(yàn)(TRUST)檢測以排除兔梅毒螺旋體感染,預(yù)先飼養(yǎng)1周使其適應(yīng)環(huán)境,并予不含有抗生素的飼料、水喂養(yǎng)。

        1.1.2 菌株 采自山東省皮膚病醫(yī)院門診疑似或確診梅毒的患者。取其皮損分泌物,共收集6例菌株。詢問病史,患者自述發(fā)病前均有不潔性交史,發(fā)病前后無抗生素服用史。其中,患者A、D的TRUST滴度較高,而Tp-PCR陰性,可能原因?yàn)榕R床標(biāo)本Tp含量低,或Tp-PCR實(shí)驗(yàn)過程中Tp-DNA提取不充分?;颊逨已在外院確診梅毒,拒絕行Tp-PCR檢測?;九R床信息見表1。本研究通過倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者簽署知情同意書。

        表1 患者基本臨床信息

        注:“-”為陰性,“N”未行Tp-PCR檢測

        1.1.3 試劑 戊巴比妥鈉(山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心惠贈(zèng)),0.9%生理鹽水,正常兔血清(NRS)(自制),梅毒螺旋體抗體檢測(TPPA)試劑盒(凝集法)(FUJIREBIO INC),梅毒甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)(TRUST)診斷試劑(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司),梅毒螺旋體(Tp)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢測試劑盒(廣州達(dá)安基因生物科技有限公司)。

        1.1.4 儀器及相關(guān)器材 2mL及5mL注射器,漩渦混合器,兔固定箱,解剖臺(tái),實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀ABI7500/7300,生物安全柜,兩套無菌手術(shù)刀、手術(shù)剪、組織鑷、止血鉗,培養(yǎng)皿,酒精棉球,離心管,離心機(jī),凍存管。

        1.2 方法

        1.2.1 臨床菌株分離 患者充分暴露皮損,無菌棉簽清潔梅毒患者皮損,拭子棉簽刮取皮損滲液。每位患者取三個(gè)拭子,一個(gè)用于Tp-PCR檢測,另兩個(gè)用于兔睪丸接種。

        1.2.2 菌懸液制備 分別向兩個(gè)拭子管內(nèi)加入800 μL 0.9%生理鹽水,室溫震蕩3 min,洗脫拭子棉簽中梅毒螺旋體,將含菌生理鹽水轉(zhuǎn)入1.5 mL無菌離心管中,加入200 μL NRS,制備為20%NRS菌懸液,4℃保存。

        1.2.3 接種 將新西蘭兔置于兔盒中,按30 mg/kg 3%戊巴比妥鈉行耳緣靜脈注射麻醉,待充分麻醉,將其固定于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作臺(tái)。按壓下腹部充分暴露兔睪丸,消毒睪丸及其周圍皮膚,先后取兩只注射器各吸取1~1.2 mL菌懸液分別注入兩側(cè)睪丸內(nèi)。接種過程中固定睪丸以防回縮,注射器針頭應(yīng)插入睪丸中間位置,防止菌懸液注入陰囊內(nèi)。當(dāng)接種凍存的菌株時(shí),需解凍至室溫,以免凍傷兔睪丸。

        1.2.4 傳代 待兔血清學(xué)檢測TPPA陽性,兔睪丸出現(xiàn)腫脹變硬時(shí),90 mg/kg 3%戊巴比妥鈉靜脈注射處死感染梅毒模型兔,將兩側(cè)睪丸分離置于無菌培養(yǎng)皿中,快速轉(zhuǎn)移至無菌安全柜內(nèi)。無菌手術(shù)刀及手術(shù)剪將睪丸切碎,移入無菌離心管內(nèi)。向離心管中加入10 mL 50% NRS(NRS與0.9%生理鹽水混合)。震蕩10 min,300×g水平離心7 min。吸取菌懸液置于無菌離心管,再接種。實(shí)驗(yàn)操作過程應(yīng)嚴(yán)格遵循無菌操作,符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理,實(shí)驗(yàn)人員做好自我防護(hù)。

        1.2.5 保存 取2 mL無菌凍存管,加入1 mL 50% NRS菌懸液,再加入1 mL 100%無菌甘油,將菌懸液與甘油輕輕吹打混勻,置于-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.6 計(jì)數(shù) 吸取50 μL菌懸液,按照梅毒螺旋體(Tp)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光檢測試劑盒說明書操作,對(duì)菌懸液進(jìn)行定性定量分析。

        1.2.7 臨床觀察與血清學(xué)檢測 接種第3天后,每隔3天觀察、觸診睪丸變化。每隔7天抽血檢測TPPA、TRUST。

        2 結(jié)果

        2.1 原代兔梅毒模型 采集6株臨床梅毒螺旋體,接種成功5株,即A、C、D、E、F株。B株兔模型于接種后因缺氧第2天死亡,可能由于麻醉期間誤吸所致。A、 C、D、E、F菌株分別于接種后第28天、7天、14天、32天、35天TPPA轉(zhuǎn)陽,A菌株梅毒兔模型一側(cè)睪丸腫大(圖1),C、D菌株梅毒兔模型雙側(cè)睪丸均發(fā)現(xiàn)腫大,D菌株兔模型一側(cè)陰囊出現(xiàn)潰瘍(圖2)。A、C、D菌株分別于接種后第49天、88天、105天處死感染兔,切除睪丸,制備菌懸液,取50 μL菌懸液行PCR熒光檢測,A、C、D分別計(jì)數(shù)為8.87×106、1.03×105、1.03×103,結(jié)果匯總見表2。

        2.2 傳代兔梅毒模型 對(duì)A菌株傳代,兔于接種后平均6天出現(xiàn)睪丸腫脹,血清學(xué)TPPA轉(zhuǎn)陽平均時(shí)間為接種后7.7天,睪丸平均分離時(shí)間為接種后13.3天,取第一、二、三代50 μL菌懸液行PCR熒光檢測計(jì)數(shù)分別為2.63×106、1.22×104、5.38×104,見表3。三代感染兔均出現(xiàn)睪丸腫脹,未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)腫大、眼損傷等臨床癥狀。

        圖1 A菌株兔模型左側(cè)睪丸腫大

        圖2 D菌株兔雙側(cè)睪丸腫大,左側(cè)陰囊見一潰瘍損害

        菌接種時(shí)間TPPA轉(zhuǎn)陽時(shí)間(d)分離時(shí)間(d)Tp-PCRA201803012849天8.87×106C20180813788天1.03×105D2018082714105天1.03×103E2018120732--F2019012135--

        注:未對(duì)E、F菌株分離

        表3 A菌株原代與傳代梅毒兔模型睪丸炎

        注:*為弱陽性

        2.3 冷凍菌株兔梅毒模型 第二代菌株凍存55天后接種于兔睪丸,第12天出現(xiàn)睪丸腫脹,第14天TPPA陽性,第39天TRUST陽性,滴度為1∶4。

        3 討論

        梅毒螺旋體體外培養(yǎng)困難,建立合適的動(dòng)物模型是研究梅毒的重要方法。研究發(fā)現(xiàn),Tp可在猿猴、白鼠、倉鼠、豚鼠、家兔體內(nèi)繁殖[5]。經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)表明,家兔是最理想的梅毒研究動(dòng)物模型,現(xiàn)已用于明確接種后各階段梅毒兔的病理生理及相關(guān)影響因素的變化,對(duì)梅毒發(fā)病機(jī)制、診斷方法、藥物治療及預(yù)后等多方面重要意義[6]。

        梅毒感染模型建立受眾多因素影響,主要包括菌株因素、宿主因素、實(shí)驗(yàn)條件因素及實(shí)驗(yàn)方法因素。首先為菌株因素,其包括菌株類型、來源及含菌量。大量研究已證實(shí)Nichols株適應(yīng)兔睪丸內(nèi)生長,而其他菌株較難適應(yīng)兔睪丸內(nèi)生長增殖[7]。不同類型菌株,其毒力不同。Nichol菌株毒力較大,1~2個(gè)Tp即可引起睪丸炎發(fā)生。如同樣接種100萬Tp,Nichols菌株和Gand菌株的持續(xù)時(shí)間分別為6~8天、39天[8]。另外,菌株來源廣泛,如梅毒患者血液、皮損分泌物、腦脊液、皮損組織等,Gayet-Ageron等[9]對(duì)Tp-PCR的敏感性及特異性進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)一期梅毒患者硬下疳分泌物和先天梅毒新生兒血液中敏感性最高。Tong等[10]對(duì)梅毒兔感染試驗(yàn)(RIT)進(jìn)行再評(píng)估,結(jié)果顯示一期患者皮損分泌物比神經(jīng)梅毒腦脊液的RIT陽性率高,且腦脊液感染所需時(shí)間更長,同時(shí)作者對(duì)樣本分析發(fā)現(xiàn)服用抗生素治療后的臨床樣本RIT陽性率較低。最新研究表明,一期、二期梅毒患者全血中Tp-DNA較潛伏梅毒高,且檢出率與患者RPR滴度有相關(guān)性[11]??梢姡黄?、二期梅毒患者更容易取到Tp。冷凍菌株感染性較弱,但可能由于菌株保存過程中菌活力降低,所以發(fā)病期延長[12]。1925年,Chesney等[13]實(shí)驗(yàn)顯示接種菌量主要影響潛伏期和持續(xù)時(shí)間,即菌量越多,潛伏期越短,而對(duì)疾病發(fā)展無明顯影響,接種最少致病菌量,同樣可使產(chǎn)生明顯的損害。

        其次為宿主,即兔及實(shí)驗(yàn)條件因素。1923年,Chesney等[14]探究了兔性別與年齡對(duì)梅毒兔模型的影響,發(fā)現(xiàn)年齡小于6個(gè)月且睪丸成熟的雄兔對(duì)Tp反應(yīng)更加明顯,所以推薦選用睪丸成熟且年齡小的雄兔作為梅毒兔模型。接種前后,兔需無抗生素食物喂養(yǎng),當(dāng)體內(nèi)含有抗生素時(shí),菌株侵襲力降低。因Tp對(duì)較高溫度不耐受,當(dāng)接種后皮膚溫度20℃以上時(shí),皮損較輕,孵育期較長,說明低溫有利于Tp的增殖,大量實(shí)驗(yàn)證明飼養(yǎng)溫度保持18℃~20℃有利于Tp生長及兔皮損形成。在夏季,盡管嚴(yán)格控制溫度,Tp生長和皮損形成缺乏穩(wěn)定性,可能由于兔體內(nèi)激素發(fā)生變化[7]。新西蘭兔實(shí)驗(yàn)前應(yīng)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房內(nèi)至少飼養(yǎng)一周,使其熟悉適應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件,有助于減少不良反應(yīng)甚至死亡發(fā)生。接種前有必要禁飲食,以防麻醉時(shí)發(fā)生胃內(nèi)容物反流而誤吸引起吸入性肺炎致命。接種后,應(yīng)密切觀察飲食、身體變化等,當(dāng)實(shí)驗(yàn)前后飲食量及身體變化較大時(shí),應(yīng)分析原因,做好準(zhǔn)備措施,以預(yù)防兔死亡。同一菌株A接種于不同新西蘭兔,TPPA轉(zhuǎn)陽時(shí)間及臨床改變不盡相同,推測可能由于兔自身的免疫功能差異所決定。接種Tp同時(shí)注射激素,可增加皮損內(nèi)Tp數(shù)量,有助于皮損形成[15]。

        梅毒兔模型的構(gòu)建,不僅受菌株因素、兔及實(shí)驗(yàn)條件的影響,另外實(shí)驗(yàn)方法同樣重要。Tp抵抗力極弱,對(duì)熱及干燥均特別敏感。血液中4℃放置72~120 h后死亡[16],56℃加熱5 min死亡或離體后干燥1~2 h即死亡,對(duì)常用化學(xué)消毒劑敏感,10~29 g/L石碳酸內(nèi)數(shù)分鐘死亡體外存活時(shí)間較短,所以需要在菌株分離、收集后的1 h內(nèi)完成接種,這就要求實(shí)驗(yàn)前應(yīng)準(zhǔn)備好試劑、器材,獲取Tp后快速接種,以免錯(cuò)過最佳存活時(shí)機(jī),從而影響菌株的增殖。制備菌懸液時(shí),可加入10%~50%正常兔血清延長Tp體外存活時(shí)間。雖有文獻(xiàn)報(bào)道Tp可體外存活數(shù)小時(shí),但隨著時(shí)間的延長會(huì)降低接種成活率,所以推薦盡快接種。Tp傳代方法很多,如皮內(nèi)、靜脈、顱內(nèi)注射,依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇接種方式,但傳統(tǒng)以睪丸內(nèi)注射為主。Chesney等[14]通過睪丸接種與皮內(nèi)接種進(jìn)行比較探究了兩者對(duì)梅毒兔模型的影響,結(jié)果顯示睪丸內(nèi)接種的兔出現(xiàn)早期反應(yīng)更加劇烈,全身損害的比率更高。國內(nèi)研究者對(duì)睪丸內(nèi)注射方法和皮下注射方法進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)前者TPPA、RPR轉(zhuǎn)陽時(shí)間較早,RPR滴度較高,臨床癥狀發(fā)生率高[17]。

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