孔祥生 劉江波 陳付英 胡小華 李 明

大皰性表皮松解癥(epidermolysis bullosa,EB)是由于角質(zhì)形成細(xì)胞或皮膚基底膜區(qū)內(nèi)的蛋白結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致的一類遺傳性皮膚病，在新生兒中的發(fā)病率接近十萬分之二[1]。其主要特點(diǎn)是患者皮膚和黏膜的脆性增加，即使是輕微的創(chuàng)傷也會(huì)引起水皰或大皰，在水皰破裂后出現(xiàn)表皮缺損和糜爛[2]。EB按照表皮的分離水平和水皰的形成位置可分為單純型大皰性表皮松解癥(epidermolysis bullosa simplex,EBS)、營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥(epidermolysis bullosa dystrophica,DEB)、交界型大皰性表皮松解癥(epidermolysis bullosa junctional,JEB)和Kindler綜合征四種主要類型[3,4]。其中EBS的水皰形成在表皮的基底細(xì)胞層，大多與編碼角蛋白的基因KRT5和KRT14發(fā)生突變有關(guān)，少數(shù)與PLEC、DST和KLHL24基因突變有關(guān)[5,6]；DEB的水皰形成在錨原纖維水平，與編碼Ⅶ型膠原蛋白的基因COL7A1發(fā)生突變有關(guān)；JEB的水皰形成在基底膜帶水平的透明板處，與編碼層粘連蛋白-332的3個(gè)多肽(α3、β3和γ2)的基因LAMA3、LAMB3和LAMC2，編碼α6β4整合素的基因ITGA6和ITGB4，編碼大皰性類天皰瘡抗原BPAG2的基因COL17A1發(fā)生突變有關(guān)[2,4,7]；而Kindler綜合征的水皰可以形成在多個(gè)位置，與FERMT1基因突變有關(guān)[3,8]。本研究通過靶向捕獲-高通量測(cè)序，結(jié)合Sanger測(cè)序檢測(cè)一例交界型大皰性表皮松解癥患兒。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 患兒，男，1歲。出生時(shí)指(趾)甲顯著肥厚，大約6個(gè)月時(shí)頸后、耳廓、腋后、臀部等易摩擦部位開始出現(xiàn)漿液性或血性水皰，部分水皰糜爛結(jié)痂(圖1)，皮損進(jìn)行性加重，同時(shí)伴有聲音嘶啞。患兒父母非近親結(jié)婚，雙方臨床表型均未見異常。

圖1a、b：患兒指(趾)甲肥厚；c～f：患兒頸后、耳廓、腋后、臀部水皰糜爛結(jié)痂

1.2 核酸提取 在取得患兒父母的知情同意后用5 mL EDTA抗凝采血管分別取患兒及患兒父母的外周血2 mL，用AxyPrep血基因組DNA小量制備試劑盒(AP-MN-BL-GDNA-250G)提取基因組DNA；分別取患兒父母的頭發(fā)20根，將毛囊部分剪到1.5 mL離心管中，各加入1 mL trizol，用天根公司RNAsimple Total RNA Kit(DP419)提取RNA。

1.3 文庫構(gòu)建 取1 μg患兒基因組DNA用covaris超聲波破碎儀打斷至片段長(zhǎng)度在150～250 bp，用羅氏公司KAPA High Throughput Library Preparation Kit(7138008001)將DNA片段經(jīng)末端補(bǔ)平、加A尾、連接接頭和PCR富集得到DNA文庫。然后將DNA文庫與探針(該探針為安百隆生物公司設(shè)計(jì)的遺傳性皮膚病檢測(cè)專用panel，由羅氏公司合成)雜交過夜，在包被有鏈霉親和素的磁珠幫助下將panel所涵蓋的與遺傳性皮膚病密切相關(guān)的541個(gè)基因的全部外顯子捕獲下來，經(jīng)PCR富集得到捕獲文庫。

1.4 高通量測(cè)序及分析 將質(zhì)檢合格的捕獲文庫用Illumina Hiseq Xten高通量測(cè)序儀測(cè)序，然后使用BWA、Samtools和Picard軟件將測(cè)序得到的reads比對(duì)到人類參考基因組GRCh37/hg19，生成的bam文件采用GATK系列軟件進(jìn)行局部重新比對(duì)，去除重復(fù)序列后檢出變異，最后使用Annovar軟件對(duì)vcf變異文件進(jìn)行注釋。以在ExAC_EAS及千人基因組數(shù)據(jù)庫中突變頻率小于0.01為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，結(jié)合患兒臨床表型分析，在LAMA3基因上找到2個(gè)雜合突變。

1.5 DNA驗(yàn)證 使用NCBI網(wǎng)站上的Primer-blast設(shè)計(jì)DNA引物，F(xiàn)1：5’-GTCTGAAGTGACCAAGGATT-3’和R1：5’-CCCATATCTAGGGCAAGTTC-3’，F(xiàn)2：5’-TACAGGTTTTTCTTGGCACT-3’和R2：5’-AGTTAGCACTGAAGTCAAGG-3’，驗(yàn)證患兒2個(gè)突變的來源。PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中DNA模板50 ng，上、下游引物各0.5 μL(10 pM)，2×Ex Taq premix(Takara)10 μL。PCR反應(yīng)在ABI Veriti PCR儀上進(jìn)行：預(yù)變性96℃ 3 min，變性96℃ 30 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收后用ABI 3730XL型全自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序(安百隆生物)。

1.6 cDNA驗(yàn)證 取正常人和患兒父母的毛囊RNA各800 ng，分別用Takara公司的PrimeScript RT Master Mix(RR036A)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用NCBI網(wǎng)站上的Primer-blast設(shè)計(jì)cDNA引物，F(xiàn)3：5’-TTGGGAGCCATTCAGAGACA-3’和R3：5’-TTCCTTTATCACTGTCTGGAGG-3’，F(xiàn)4：5’-CTTGGCTCACTCTGTATTGT-3’和R4：5’-CTACTGTCTGTGTCCAGTTC-3’，驗(yàn)證2個(gè)突變對(duì)RNA剪接的影響。PCR體系及擴(kuò)增條件與DNA驗(yàn)證中相同，PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收后用ABI3730XL型全自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序。

2 結(jié)果

通過靶向捕獲-高通量測(cè)序在JEB的致病基因LAMA3(NM_001127718.2)上找到2個(gè)影響RNA剪接的雜合突變：exon12: c.1478+5G>A和exon34:c.4647+5G>C。DNA驗(yàn)證結(jié)果表明患兒的這2個(gè)突變分別遺傳自其父親和母親(圖2)。cDNA驗(yàn)證結(jié)果表明c.1478+5G>A導(dǎo)致mRNA上發(fā)生了缺失(圖3a)，即c.1381_1478del，原因是12號(hào)外顯子3’端剪接位點(diǎn)前移了98bp(圖4a)，c.4647+5G>C導(dǎo)致mRNA上發(fā)生了插入(圖3b)，即c.4647_4648ins74，原因是34號(hào)外顯子3’端剪接位點(diǎn)后移了74 bp(圖4b)，即插入序列為c.4647+1_4647+74。檢索HGMD數(shù)據(jù)庫(http://www.hgmd.org)、LOVD數(shù)據(jù)庫(http://www.lovd.nl/LAMA3)以及最新LAMA3基因相關(guān)文獻(xiàn)均未見有關(guān)以上兩個(gè)突變的報(bào)道。

圖2a：患兒(S)c.1478+5G>A遺傳自其父親(F)；b：患兒(S)c.4647+5G>C遺傳自其母親(M)

圖3a：患兒父親(2泳道)與正常人(1泳道)相比，mRNA上有缺失；b：患兒母親(2泳道)與正常人(1泳道)相比，mRNA上有插入圖4A1和A3為圖3a中444bp條帶測(cè)序結(jié)果，A2為圖3a中346bp條帶測(cè)序結(jié)果；B1和B3為圖3b中353bp條帶測(cè)序結(jié)果，B2為圖3b中279bp條帶測(cè)序結(jié)果

3 討論

交界型大皰性表皮松解癥與其他幾種類型相比，不但基因雜合程度高，而且往往癥狀較重。特別是當(dāng)LAMA3、LAMB3和LAMC2這三個(gè)基因中的任何一個(gè)發(fā)生突變時(shí)都可能導(dǎo)致層粘連蛋白-332的含量顯著降低甚至消失，因而往往具有致死性[3，9，10]，這種類型稱為嚴(yán)重泛發(fā)型交界型大皰性表皮松解癥。層粘連蛋白-332局限于鱗狀上皮，如皮膚的基底膜中，它定位于錨絲并與半橋粒相連，對(duì)基底膜的構(gòu)建和穩(wěn)定具有非常重要的作用[11]。嚴(yán)重泛發(fā)型交界型大皰性表皮松解癥十分罕見，在新生兒中的發(fā)病率在0.00004%～0.0004%[9]，患兒常在出生時(shí)即有嚴(yán)重廣泛性分布的大皰和大面積的皮膚剝脫，可于數(shù)日至數(shù)月內(nèi)死亡，嬰兒如幸存，其后仍可發(fā)生生長(zhǎng)遲緩及中或重度的頑固性貧血，多數(shù)于2歲內(nèi)死亡[12]。

本次檢測(cè)到的LAMA3基因上的兩個(gè)突變：c.1478+5G>A位于12號(hào)外顯子的下游，導(dǎo)致在RNA剪接時(shí)12號(hào)外顯子3’端的98bp外顯子片段丟失，翻譯時(shí)出現(xiàn)移碼并在第469位形成提前終止密碼子(p.Val461AspfsX9)；c.4647+5G>C位于34號(hào)外顯子下游，導(dǎo)致在RNA剪接時(shí)34號(hào)外顯子下游的74 bp內(nèi)含子片段被插入到34號(hào)和35號(hào)外顯子之間，翻譯時(shí)出現(xiàn)移碼并在第1557位形成提前終止密碼子(p.Thr1551CysfsX7)，二者均導(dǎo)致LAMA3基因的編碼蛋白錯(cuò)誤和截短，直接引起其功能改變。

交界型大皰性表皮松解癥預(yù)后差，至今無有效治療方法，產(chǎn)前診斷是主要干預(yù)手段。我們應(yīng)用靶向捕獲-高通量測(cè)序技術(shù)在本例患兒中新發(fā)現(xiàn)2個(gè)影響RNA剪接的突變，增加了中國人群LAMA3基因的突變數(shù)據(jù)庫，為該患兒的父母預(yù)防下一胎患病所需的產(chǎn)前診斷打下了基礎(chǔ)，也為探討該病的發(fā)病機(jī)制以及將來的基因治療提供了參考。