徐 銳，陳 中

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.美贊臣營(yíng)養(yǎng)品(中國(guó))有限公司，廣東 廣州 510730)

維生素A(vitamin A)又名視黃醇，屬于脂溶性生素，維生素A對(duì)于嬰幼兒的骨骼和視力的生長(zhǎng)發(fā)育有很大的作用。維生素A不但可以維持正常的視覺(jué)功能防止夜盲癥，而且還具有維持上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整與健康、促進(jìn)機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)機(jī)體的造血功能和預(yù)防癌癥等十分重要的功能[1-2]。維生素E(vitamin E)又名抗不育維生素或生育酚，具有抗不育功能和抗氧化作用[3]。生育酚是人體不可缺少的營(yíng)養(yǎng)素，其四種異構(gòu)體的構(gòu)型與磷脂中多不飽和脂肪酸的構(gòu)型互補(bǔ)而具有較強(qiáng)的清除氧自由基能力，保護(hù)組織完整性，在生命過(guò)程中起重要作用。維生素E包括生育酚和三烯生育酚兩類(lèi)共8種化合物，即α、β、γ、δ生育酚和α、β、γ、δ三烯生育酚，其中α-生育酚分布最廣、生物活性最高，δ-生育酚抗氧化能力最強(qiáng)。生育酚對(duì)人體有重要的生理功能，具有抗氧化、抗衰老、抗不育、調(diào)節(jié)免疫力等作用，對(duì)生殖功能﹑細(xì)胞代謝均有影響[3]。維生素A和維生素E是嬰幼兒奶粉中一重要營(yíng)養(yǎng)添加劑，其含量必須經(jīng)過(guò)檢測(cè)，因此建立維生素A和維生素E的檢測(cè)方法對(duì)監(jiān)測(cè)其含量意義重大。

目前測(cè)定奶粉中維生素A和維生素E的方法有紫外分光光度法、薄層層析法、熒光法、氣相色譜法和高效液相色譜法[4-9]等，高效液相色譜法(以下簡(jiǎn)稱(chēng)HPLC法)具有快速、準(zhǔn)確、樣品前處理簡(jiǎn)單以及分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，HPLC法分為反相HPLC法和正相HPLC法，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 5009.82-2003[6]、GB 5413.9-2010[7]和GB5009.82-2016[8]屬于皂化-反相色譜法，但是反相HPLC法在測(cè)定維生素A和維生素E時(shí)出峰時(shí)間長(zhǎng)，分離維生素E的四種異構(gòu)體時(shí)峰型和分離度欠佳，對(duì)柱子和柱溫要求過(guò)高，一般柱子無(wú)法分離β-生育酚和γ-生育酚，C30柱又需要控制在柱溫20℃，對(duì)于一些小的實(shí)驗(yàn)室很難滿(mǎn)足這個(gè)要求。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法AOAC Offcial Method 2012.10[9](AOAC法)屬于直接提取-正相色譜法，AOAC法可以實(shí)現(xiàn)維生素A和維生素E四種異構(gòu)體的完美分離，維生素A和維生素E時(shí)出峰時(shí)間長(zhǎng)，且同時(shí)用到紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器，所以尋求一種的方法去測(cè)定維生素A和維生素E四種異構(gòu)體的含量意義重大，皂化-正相HPLC法綜合皂化-反相色譜法和直接提取-正相色譜法的優(yōu)點(diǎn)可以快速正確測(cè)定維生素A和維生素E四種異構(gòu)體的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

視黃醇標(biāo)準(zhǔn)品和α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚標(biāo)準(zhǔn)品(含量≥95%)，美國(guó)Sigma公司；正己烷、四氫呋喃均為色譜純，J.T.Baker；氫氧化鈉、無(wú)水乙醇均為分析純，廣州化學(xué)試劑；BHT，美國(guó)Sigma公司。

Cary 60紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)Agilent公司；HZS-HA水浴振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；AB304-S型電子天平：瑞士梅特勒一托利多公司；2690型高效液相色譜儀配2487型紫外檢測(cè)器：美國(guó)Waters公司。

1.2 試劑及標(biāo)準(zhǔn)品制備

1.2.1 試劑制備

氫氧化鈉溶液(10 mol/L)：稱(chēng)取400 g氫氧化鈉用milli-Q水溶解并定容至1 L，有效期三周。

0.1%BHT乙醇溶液(m/v)：稱(chēng)取1 gBHT用乙醇溶解并定容至1 L，有效期一個(gè)月。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品制備

維生素 A 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(視黃醇)(0.5 mg/mL)：精確稱(chēng)取25 mg的維生素 A 標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷溶解并定容于 50 mL 棕色容量瓶中，在-20℃下避光保存，效期1個(gè)月。臨用前將溶液回溫至20℃，并進(jìn)行濃度校正。

維生素 E 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(α-生育酚)(1.0 mg/mL)：精確稱(chēng)取50 mg的維生素E標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷溶解并定容于 100 mL 棕色容量瓶中。在-20℃下避光保存，有效期6個(gè)月。臨用前將溶液回溫至20℃，并進(jìn)行濃度校正。

維生素 E 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(β-生育酚)(1.0 mg/mL)：精確稱(chēng)取50 mg的維生素E標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷溶解并定容于 100 mL 棕色容量瓶中。在-20℃下避光保存，有效期6個(gè)月。臨用前將溶液回溫至20℃，并進(jìn)行濃度校正。

維生素 E 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(γ-生育酚)(1.0 mg/mL)：精確稱(chēng)取50 mg的維生素 E標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中。在-20℃下避光保存，有效期6個(gè)月。臨用前將溶液回溫至20℃，并進(jìn)行濃度校正。

維生素 E 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(δ-生育酚)(1.0 mg/mL)：精確稱(chēng)取50 mg的維生素E標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中。在-20 ℃下避光保存，有效期6個(gè)月。臨用前將溶液回溫至20℃，并進(jìn)行濃度校正。

維生素A 和維生素E混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液：準(zhǔn)確吸取維生素A 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1.00 mL和維生素E 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各5.00 mL于同一50 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，此溶液中維生素A 濃度為10.0 μg/mL，維生素E各生育酚濃度為100 μg/mL。在-20℃下避光保存，有效期半個(gè)月。維生素A和維生素E標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液：分別準(zhǔn)確吸取維生素A和維生素E混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，用正己烷定容至刻度，該標(biāo)準(zhǔn)系列中維生素A濃度為0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00 μg/mL，維生素E濃度為2.00、5.00、10.0、20.0、40.0、60.0 μg/mL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

精確稱(chēng)取2～5 g奶粉樣品于150 mL三角瓶中，加入20 mL溫水溶解，再30 mL 0.1% BHT乙醇溶液和9 mL10 mol/L氫氧化鈉溶液，于60℃水浴鍋皂化40 min，轉(zhuǎn)移至250 mL分液漏斗，分別用50 mL正己烷萃取2次，再用mill-Q水水洗至中性，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水處理，在50℃旋蒸至2 mL左右氮吹至干，用正己烷溶解轉(zhuǎn)移并定容至10 mL棕色容量瓶中，過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜，上機(jī)待測(cè)。

1.3.2 色譜條件

流動(dòng)相A為純四氫呋喃，流動(dòng)相B為純正己烷， 采用等度洗脫，正己烷：四氫呋喃=90:10，α-生育酚的保留時(shí)間是2.9 min，β-生育酚的保留時(shí)間是3.2 min，γ-生育酚的保留時(shí)間是3.6 min，δ-生育酚的保留時(shí)間是4.0 min，維生素A的保留時(shí)間是7.9 min。流速為 1.5 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)分別為294 nm和325 nm，柱溫40℃，進(jìn)樣量25 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件

本試驗(yàn)的目的是研究高效液相色譜法正相法同時(shí)測(cè)定奶粉中的維生素A和4種維生素E異構(gòu)體的含量方法。樣品經(jīng)過(guò)皂化、正己烷萃取分離純化后，用硅膠柱zorbax Rx-SIL直接分離維生素A和4種維生素E異構(gòu)體。在諸多色譜條件中，流動(dòng)相的選擇是分析方法研發(fā)的重點(diǎn)。流動(dòng)相中四氫呋喃的比例對(duì)異構(gòu)體保留時(shí)間有較大影響，當(dāng)流動(dòng)相正己烷：四氫呋喃比例為96∶4時(shí)，維生素A和4種維生素E異構(gòu)體分離效果最佳，但是保留時(shí)間比較長(zhǎng)，優(yōu)化色譜條件后正己烷：四氫呋喃比例為90∶10，柱溫40℃，流速為1.5 mL/min，維生素A和4種維生素E異構(gòu)體完全分離，5種物質(zhì)8 min內(nèi)出峰(見(jiàn)圖1示)。

1.α-生育酚;2.β-生育酚;3.γ-生育酚;4.δ-生育酚;5.VA

圖1 4種生育酚和維生素A正相高效液相色譜圖

Fig.1 High performance liquid chromatography of 4 tocopherols and vitamin A

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線(xiàn)性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限

按照1.2.2配置一系列不同質(zhì)量濃度生育酚和維生素A混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)樣分析，以目標(biāo)物的峰面積y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可以看出，生育酚在2～60μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，維生素A在0.2～60 μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，滿(mǎn)足檢測(cè)需求。檢出限和定量限以向空白樣品中逐級(jí)降低加標(biāo)濃度的方法來(lái)確定，以色譜峰信噪比(S/N)*3為方法的檢出限，信噪比(S/N)*10為定量限。生育酚的檢出限為0.07～0.14 mg/kg，生育酚的定量限為0.12～0.4 mg/kg，維生素A的檢出限為0.02 mg/kg，維生素A的定量限為0.04 mg/kg。

表1 4種生育酚和維生素A的線(xiàn)性關(guān)系、線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.2.2 方法重現(xiàn)性、回收率和精密度

取標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.2 μg/mL)連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算峰面積之間的RSD%，用來(lái)確定儀器精密度。結(jié)果顯示，維生素A、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和維生素A的RSD分別為0.81%、0．25%、 0.39%、1.64%、1.44%，均小于3%，重現(xiàn)性良好。用奶粉進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，加不同濃度3個(gè)級(jí)別的標(biāo)準(zhǔn)，平行2份，因?yàn)槟谭壑芯S生素A和維生素E主要是以視黃醇和α-生育酚為主，β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚含量很低，所以加標(biāo)只加維生素A和α-生育酚，計(jì)算方法回收率及精密度。結(jié)果顯示，在線(xiàn)性范圍內(nèi)，維生素A的回收率范圍為84.05%～89.17%，α-生育酚的回收率范圍為85.36%～91.29%，在80%～100%范圍內(nèi)；RSD分別為3.27%、3.77%，均在5%范圍以?xún)?nèi)。以上顯示，該方法具有良好的重現(xiàn)性和精密度，能夠開(kāi)展奶粉中的維生素A和四種維生素E異構(gòu)體的含量測(cè)定研究。

2.3 樣品實(shí)測(cè)結(jié)果

選取2種奶粉樣品用高效液相色譜法分別測(cè)定2種奶粉的維生素A和4種維生素E異構(gòu)體含量，平行2份，最終計(jì)算出維生素A和維生素E含量，按上述樣品處理和色譜方法，測(cè)定維生素A和維生素E含量，結(jié)果見(jiàn)表2，樣品色譜圖見(jiàn)圖2，結(jié)果顯示奶粉中4種維生素E異構(gòu)體的含量以α-生育酚的含量最高，其他3種生育酚含量較低，參考GB5009.82-2016計(jì)算方式：維生素E(mg α-TE/100 g)=α-生育酚(mg/100 g)+β-生育酚(mg/100 g)×0.5+γ-生育酚(mg/100 g)×0.1+δ-生育酚(mg/100 g)×0.01。最終維生素A和維生素E的結(jié)果均在奶粉樣品的標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。

表2 維生素A和維生素E的含量

圖2 樣品色譜圖

Fig.2 Sample chromatogram

奶粉樣品1維生素A的標(biāo)準(zhǔn)含量范圍是430～990 μg/100 g，奶粉樣品1維生素E的標(biāo)準(zhǔn)含量范圍是4.98～11.09 mg/100 g，奶粉樣品2維生素A的標(biāo)準(zhǔn)含量范圍是477～897 μg/100g，奶粉樣品2維生素E的標(biāo)準(zhǔn)含量范圍是3.22～10.00 mg/100g，從表2結(jié)果來(lái)看，2個(gè)奶粉樣品的維生素A和維生素E的結(jié)果均在奶粉樣品的標(biāo)準(zhǔn)含量范圍內(nèi)。

2.4 樣品比對(duì)結(jié)果

選取1種奶粉樣品用本文建立的方法和國(guó)標(biāo)方法(GB5009.82-2016第一法)同時(shí)測(cè)定該奶粉中的維生素A和4種維生素E異構(gòu)體含量，平行2份，最終計(jì)算出維生素A和維生素E含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 維生素A和維生素E的含量

從表3結(jié)果來(lái)看：GB5009.82-2016第一法和本法檢測(cè)結(jié)果差值<5%，無(wú)顯著差異，本法可以用來(lái)檢測(cè)奶粉中維生素A和維生素E含量。

3 結(jié)論

選用Agilent Zorbax RX-SIL柱正相分離維生素A和α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚，以正己烷-四氫呋喃(90∶10)為流動(dòng)相，等度洗脫，流速1.5 mL/min，在294 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)維生素E，在325 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)維生素A，分離效果較佳，實(shí)際檢測(cè)奶粉樣品，其結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，與國(guó)標(biāo)方法GB5009.82-2016第一法進(jìn)行方法對(duì)比，結(jié)果無(wú)差異，證明該方法可以快速、準(zhǔn)確地測(cè)定奶粉中維生素E和維生素A的含量。