蔣藝佳，肖雯雯，聶 政，敖陽(yáng)思琦，李慕曉，何 沛，周金林，趙俊龍，賀 蘭

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

巴貝斯蟲(chóng)病是由巴貝斯屬的多種巴貝斯蟲(chóng)寄生于動(dòng)物紅細(xì)胞內(nèi)引起的一種血液原蟲(chóng)病，為人畜共患病[1]。該病主要通過(guò)硬蜱傳播，也可通過(guò)輸血傳播和胎盤傳播，其發(fā)生與流行具有明顯的季節(jié)性和地區(qū)性。發(fā)病的典型癥狀為高熱、溶血性貧血、黃疸、血紅蛋白尿等，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡。一般免疫正常的人感染巴貝斯蟲(chóng)后無(wú)明顯臨床癥狀，但當(dāng)其免疫力下降時(shí)，癥狀表現(xiàn)明顯，危害極大。

據(jù)文獻(xiàn)[2]報(bào)道，多種巴貝斯蟲(chóng)具有人畜共患的能力，其中一種即為田鼠巴貝斯蟲(chóng)（Babesia microti，B. microti）。1969年，美國(guó)東海岸報(bào)道了一例人的巴貝斯蟲(chóng)病，其病原為田鼠巴貝斯蟲(chóng)。此后相似病例相繼發(fā)生，在當(dāng)?shù)匾饦O大轟動(dòng)，隨后美國(guó)建立了專門研究田鼠巴貝斯蟲(chóng)的實(shí)驗(yàn)室；1977年，臺(tái)灣報(bào)道了嚙齒類巴貝斯蟲(chóng)感染病例。同年，研究人員在幾位居民血清中檢驗(yàn)出田鼠巴貝斯蟲(chóng)抗體。近年來(lái)，田鼠巴貝斯感染人的相關(guān)病例逐漸增多[3]，引起人們的重視。

巴貝斯蟲(chóng)的分子生物學(xué)研究表明，多種蛋白在蟲(chóng)體感染機(jī)體的過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用。GPI錨定裂殖子表面抗原（merozoite surface antigen，MSA）包裹在蟲(chóng)體表面，從而有效地與靶細(xì)胞黏附，且編碼該抗原的表位基因片段存在大量多態(tài)性，可能與牛巴貝斯蟲(chóng)的免疫逃避機(jī)制有關(guān)[4-6]；頂膜抗原1（apical membrane antigen-1，AMA1）是一種分泌到蟲(chóng)體表面的蛋白，其中分歧巴貝斯蟲(chóng)天然AMA1的蛋白水解產(chǎn)物可與紅細(xì)胞表面的相關(guān)受體結(jié)合，在蟲(chóng)體入侵紅細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用[7-8]；棒狀體相關(guān)蛋白1（rhoptry-associated protein1，RAP1）存在于所有的巴貝斯蟲(chóng)種類中，且針對(duì)該蛋白的一些抗體可阻斷裂殖子的入侵，預(yù)示該蛋白可作為巴貝斯蟲(chóng)免疫性保護(hù)的重要靶標(biāo)[9-10]。

然而，目前對(duì)田鼠巴貝斯蟲(chóng)的研究相對(duì)較少，對(duì)該病的診斷主要依賴于紅細(xì)胞染色鏡檢，存在染蟲(chóng)率低及非急性感染診斷困難的問(wèn)題。因此，建立檢測(cè)田鼠巴貝斯蟲(chóng)血清學(xué)檢測(cè)方法極為重要。有研究表明，一種新型的田鼠巴貝斯蟲(chóng)分泌蛋白（BmSA1）具有良好的診斷潛力[11]，但全長(zhǎng)蛋白的表達(dá)量少，也不宜純化。因此，探索是否存在其他可作為田鼠巴貝斯蟲(chóng)血清學(xué)檢測(cè)的候選分子極其有意義。

本實(shí)驗(yàn)以田鼠巴貝斯蟲(chóng)RAPIF1基因?yàn)檠芯繉?duì)象，利用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)其進(jìn)行序列分析[12-13]，預(yù)測(cè)其親水性/疏水性、跨膜區(qū)、信號(hào)肽、翻譯后修飾位點(diǎn)、B淋巴細(xì)胞抗原表位等特性；并通過(guò)克隆載體與表達(dá)載體的構(gòu)建[14-15]，對(duì)其進(jìn)行基因克隆與原核表達(dá)；運(yùn)用SDS-PAGE、Western blot等方法檢測(cè)其免疫反應(yīng)原性，評(píng)價(jià)RAPIF1是否具有成為田鼠巴貝斯蟲(chóng)診斷和疫苗制備候選分子的可能。

1 材料與方法

1.1 蟲(chóng)株、菌株、載體、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑 田鼠巴貝斯蟲(chóng)（Babesia microti，B. microti）PRA-99株由本實(shí)驗(yàn)室提供，液氮保存；田鼠巴貝斯蟲(chóng)陽(yáng)性血清由人工感染實(shí)驗(yàn)制備，保存于-20℃；Balb/c小鼠、昆明鼠購(gòu)于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、BL21由本實(shí)驗(yàn)室制備，-80℃保存；克隆載體pEASY-Blunt、表達(dá)載體pET-28a(+)購(gòu)于北京氏金生物技術(shù)有限公司，-20℃保存；限制性內(nèi)切酶BamH 1、Xho1、TaqDNA聚合酶、dNTPs購(gòu)自寶生生物工程（大連）有限公司，-20℃保存。氨芐青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、二硫蘇糖醇（DTT）、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）購(gòu)自Amresco公司；牛血清白蛋白（BSA）、咪唑、考馬斯亮藍(lán)R250購(gòu)自Biosharp公司；弗氏完全與不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司；預(yù)染與非預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自Thermo公司；血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；DNA膠回收試劑盒、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、His-tag鎳親和層析介質(zhì)（ProteinPure Ni-NTA Resin）購(gòu)自北京全氏金生物技術(shù)有限公司；蛋白濃度測(cè)定試劑盒、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG購(gòu)自江蘇南通碧云天生物科技研究所；LB液體培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室制備，高壓蒸汽滅菌后備用；其他各類試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 DNA模板的提取與DNA回收 根據(jù)田鼠巴貝斯蟲(chóng)RAPIF1基因的核苷酸序列（GenBank登錄號(hào)：XP_012647190.1），利用Clone Manager 8軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，上游引物：5'-ATGGGCCTTTCTGATAATCTG- 3'，下游引物：5'-TTAACAGCCAATGCAACCAG- 3'。引物由上海生工生物工程有限公司合成。用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取田鼠巴貝斯蟲(chóng)gDNA，擴(kuò)增其開(kāi)放閱讀框。用DNA膠回收試劑盒回收目的片段。具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 RAPIF1基因的原核表達(dá) 根據(jù)同源重組原理，利用Clone Manager 8軟件設(shè)計(jì)RAPIF1的特異性引物，上游引物：5'-GCAAATGGGTCGCGGATCCA TGGGCCTTTCTGATAATCTGTGC-3'，下游引物：5'-GGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTAACAGCCA ATGCAACCAGC-3'。引物由上海生工生物工程有限公司合成。用特異性引物和KD酶擴(kuò)增RAPIF1，膠回收擴(kuò)增產(chǎn)物。將回收產(chǎn)物與表達(dá)載體pET-28α相連接后。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，37℃振蕩培養(yǎng)1 h，涂布在含有卡那霉素平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取平板上的單菌落，PCR鑒定，篩選陽(yáng)性克隆。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21，同樣篩選陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆菌振蕩培養(yǎng)3 h，使菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入誘導(dǎo)劑IPTG 0.8 mmol/L，28℃振蕩培養(yǎng)12 h，誘導(dǎo)其表達(dá)重組蛋白。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。取1.5 mL菌液，8000 ×g離心3 min，去上清；用40 μL ddH2O重懸沉淀；加50 μL 2% SDS上樣緩沖液，加10 μL DTT（二硫蘇糖醇）；沸水浴10 min，冰浴5 min。每孔上樣10 μL，跑膠；考馬斯亮藍(lán)染色液染色2 h，脫色液脫色至條帶清晰可見(jiàn)。

1.4 重組蛋白的純化 將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液，在4℃的條件下，集菌，用壓力破碎儀破碎3次，12 000×g離心10 min，分離上清與包涵體，將上清經(jīng)過(guò)濾器過(guò)濾后與鎳柱結(jié)合2 h，然后分別用5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%咪唑洗脫。處理不同濃度咪唑的洗脫物，SDSPAGE電泳，收集洗脫蛋白，于PBS溶液中透析48 h，用蔗糖濃縮。

1.5 多克隆抗體的制備 在免疫昆明鼠前，采血獲陰性血清。將濃度為0.5 mg/mL的rRAPIF1與佐劑1∶1混合乳化，皮下注射免疫昆明鼠，每次免疫的rRAPIF1量為50 μg。分別于免疫后的0、14、28 d進(jìn)行一免、二免和三免，三免后間隔10 d加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫后7 d收集鼠血清，經(jīng)純化獲得多克隆抗體。

1.6 Western blot 處理純化的重組蛋白與全蟲(chóng)抗原樣品，SDS-PAGE電泳，將3層濾紙、凝膠、NC膜、3層濾紙按順序疊放在電轉(zhuǎn)儀陰極石墨板中央，電壓最大值，電流1.0 mA/cm2大小 ，穩(wěn)流電轉(zhuǎn)2 h。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，用5%脫脂奶4℃封閉過(guò)夜，TBST洗膜，3 min洗3次，5 min洗5次。加入用TBST 1∶400稀釋的血清，室溫孵育2 h，洗膜。加入用TBST 1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，室溫避光孵育1 h，同上洗膜。用Odyssey CLx（紅外激光成像儀）照膠。

2 結(jié)果

2.1 基因克隆與鑒定 利用設(shè)計(jì)的特異性引物從田鼠巴貝斯蟲(chóng)基因組中擴(kuò)增出771 bp的目的片段（圖1）。將該片段與克隆載體pEASY-Blunt連接，轉(zhuǎn)化克隆后，挑取陽(yáng)性克隆用BamH1/Xho1雙酶切鑒定：兩個(gè)片段大小分別為852、3848 bp（圖1）。目的片段的序列與田鼠巴貝斯蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的RAPIF1基因序列比對(duì)結(jié)果顯示，序列一致性為100%。

2.2 序列分析

2.2.1 基本理化性質(zhì) 利用ExPASy-ProtParam工具分析可知，RAPIF1基因編碼256個(gè)aa（圖2），分子質(zhì)量為29 kDa，等電點(diǎn)為5.09，在水中280 nm處的摩爾消光系數(shù)為27 305 mol/cm。該蛋白分子式是C1289H2068N340O403S11，富含纈氨酸、谷氨酸、賴氨酸、異亮氨酸等，其中纈氨酸占比13.7%。在體外哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)的半衰期為30 h，體外酵母菌內(nèi)的半衰期＞20 h，體外大腸桿菌內(nèi)的半衰期＞10 h，不穩(wěn)定系數(shù)為39.25，可認(rèn)為其屬于穩(wěn)定蛋白。脂肪指數(shù)為89.26，親水性平均系數(shù)為-0.409，為親水性蛋白。

2.2.2 親水性/疏水性 利用ExPASy-ProtScale、Kyte&Doolittle分析可知，該蛋白含有多個(gè)親水區(qū)，分別位于氨基酸序列位點(diǎn)8～54、82～89、124～132、146～207、240～250（圖3A），結(jié)合其親水性平均系數(shù)為-0.409，可進(jìn)一步證明其為親水性蛋白。

2.2.3 跨膜區(qū) 跨膜區(qū)的主要作用是把膜蛋白固定在細(xì)胞膜上，因此分析蛋白質(zhì)是否含有跨膜區(qū)，對(duì)其定位與定性具有指示意義。利用TMHMM隱馬爾科夫模型分析顯示，該蛋白無(wú)跨膜區(qū)，預(yù)測(cè)其不是跨膜蛋白（圖3B）。

圖1 RAPIF1基因的PCR擴(kuò)增與pEASY-Blunt- RAPIF1重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.1 PCR amplification results of RAPIF1 gene and identification of pEASY-Blunt-RAPIF1 recombinant plasmid with restrictive enzyme digestion

2.2.4 信號(hào)肽 利用SignalP 4.1 server對(duì)蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，C-score為信號(hào)肽剪切位點(diǎn)分值，S-score為信號(hào)肽位點(diǎn)分值，Y-score為綜合位點(diǎn)剪切分值。結(jié)果顯示，C-score、S-score、Y-score三值波動(dòng)幅度較小，且無(wú)突出Y-score的最大值，判斷該蛋白無(wú)信號(hào)肽（圖3C）。

2.2.5 翻譯后修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè) 利用Motif scan對(duì)該蛋白的修飾性位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，序列中存在酪蛋白激酶2磷酸化位點(diǎn)3個(gè)，N-?；稽c(diǎn)1個(gè)，蛋白激酶c磷酸化位點(diǎn)4個(gè)，N-糖基化位點(diǎn)1個(gè)（表1）。

2.2.6 B淋巴細(xì)胞抗原表位分析 B細(xì)胞表位通常能被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫。為進(jìn)步探究其作為疫苗或者診斷分子的可能性，利用DNASTAR對(duì)RAPIF1潛在B細(xì)胞的表位進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，RAPIF1存在7個(gè)主要的B淋巴細(xì)胞抗原表位，其氨基酸序列位點(diǎn)分別為23～26、39～46、127～131、152～155、168～174、203～207和245～249（表2、圖4）。

2.3 原核表達(dá)與純化 將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，對(duì)挑取的單菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定。將鑒定驗(yàn)證為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒pET-28a-RAPIF1轉(zhuǎn)入E.coliBL21中誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物命名為rRAPIF1。SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示，誘導(dǎo)樣品在37 kDa處條帶明顯增粗（圖5）。根據(jù)RAPIF1大小為29 kDa，pET-28a重組載體表達(dá)的His標(biāo)簽大小為8 kDa可知，rRAPIF1大小與理論預(yù)測(cè)值相符。純化rRAPIF1蛋白電泳結(jié)果顯示清晰的單一條帶，大小為37 kDa，見(jiàn)圖5。

圖2 RAPIF1的開(kāi)放閱讀框核苷酸與氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and amino acid sequences of RAPIF1 ORF

2.4 反應(yīng)原性鑒定 rRAPIF1分別與田鼠巴貝斯蟲(chóng)陽(yáng)性血清和陰性血清與之反應(yīng)，結(jié)果顯示陽(yáng)性血清與重組蛋白在37 kDa處有單一的反應(yīng)條帶，而陰性血清無(wú)任何條帶（圖6），表明該重組抗原可有效區(qū)分田鼠巴貝斯蟲(chóng)陰性陽(yáng)性血清，具有良好的反應(yīng)原性。用田鼠巴貝斯蟲(chóng)全蟲(chóng)抗原，分別與RAPIF1的多克隆抗體和鼠陰性血清反應(yīng)，結(jié)果顯示僅多克隆抗體與全蟲(chóng)抗原29 kDa處顯示單一的條帶（圖6），表明RAPIF1存在于蟲(chóng)體中。

圖3 RAPIF1的特性分析Fig.3 Analysis of RAPIF1

表1 RAPIF1的功能性位點(diǎn)預(yù)測(cè)Table 1 Post-translational modification(PTM)sites of the putative RAPIF1

表2 RAPIF1的B淋巴細(xì)胞抗原表位氨基酸序列Table 2 Potential B cell antigen epitopes position and sequences

圖4 RAPIF1的B淋巴細(xì)胞抗原表位分析Fig.4 Potential B cell antigen epitopes prediction of RAPIF1

圖5 rRAPIF1的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of rRAPIF1

圖6 rRAPIF1的Western blot 分析Fig.6 Western blot analysis of rRAPIF1

3 討論

棒狀體相關(guān)蛋白1（RAP1）存在于所有巴貝斯蟲(chóng)中，在蟲(chóng)體入侵過(guò)程中起到重要作用，且針對(duì)該蛋白的一些抗體可阻斷或抑制蟲(chóng)體入侵[16]。因此，RAP1的功能研究、特異性疫苗制備與靶向藥物篩選是預(yù)防與治療巴貝斯蟲(chóng)病的一個(gè)重要方向。根據(jù)其他一些巴貝斯蟲(chóng)入侵相關(guān)因子[17-18]，如GPI錨定裂殖子表面抗原（MSA）、頂膜抗原1（AMA1）、凝血酶敏感素相關(guān)無(wú)名蛋白（TRAP）[19]、硫氧還蛋白（Trx）與硫氧還蛋白還原酶（Trx R）[20]等在蟲(chóng)體入侵過(guò)程中發(fā)揮的重要作用，這些分子極有可能成為巴貝斯蟲(chóng)免疫性保護(hù)的重要靶標(biāo)。

然而，目前田鼠巴貝斯蟲(chóng)病的相關(guān)研究及成果仍相對(duì)較少，主要集中在蟲(chóng)體侵襲過(guò)程中一些較為明確的重要抗原上，對(duì)其他一些未知因子的研究尚不清楚或深入。因此，在本研究中，我們將目光投向田鼠巴貝斯蟲(chóng)棒狀體蛋白相關(guān)因子1（RAPIF1），探索RAPIF1是否具有類似于RAP1的免疫特性，在蟲(chóng)體感染過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。

本研究根據(jù)已報(bào)道的田鼠巴貝斯蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)計(jì)特異性引物，成功擴(kuò)增到RAPIF1基因，其全長(zhǎng)771 bp，編碼256 aa。利用多種生物信息學(xué)分析軟件對(duì)RAPIF1的基本理化性質(zhì)、親水性/疏水性、跨膜區(qū)、信號(hào)肽、翻譯后修飾位點(diǎn)及B淋巴細(xì)胞抗原表位等進(jìn)行預(yù)測(cè)[21]，該蛋白為親水性蛋白，無(wú)跨膜區(qū)與信號(hào)肽，有較豐富的修飾性位點(diǎn)與B淋巴細(xì)胞抗原表位。

本實(shí)驗(yàn)在獲得田鼠巴貝斯RAPIF1的cDNA（全長(zhǎng)771 bp）的基礎(chǔ)上，將RAPIF1插入表達(dá)載體pET-28a中，并在大腸桿菌BL21中成功地表達(dá)了重組蛋白rRAPIF1。rRAPIF1在上清和包涵體中均有表達(dá)，且以上清表達(dá)形式為主。本研究利用His鎳柱純化重組蛋白，獲得了純度較高的蛋白。免疫印跡分析表明，rRAPIF1與田鼠巴貝斯蟲(chóng)陽(yáng)性血清反應(yīng)，說(shuō)明該蛋白具有良好的反應(yīng)原性，免疫后的多克隆抗體可與全蟲(chóng)抗原反應(yīng)，說(shuō)明RAPIF1存在于蟲(chóng)體中，RAPIF1預(yù)期可作為田鼠巴貝斯蟲(chóng)疫苗制備的候選抗原。