郭 帥，范志宇，王 芳，朱偉峰，仇汝龍，魏后軍，胡 波，宋艷華，陳萌萌，徐為中

（江蘇省農業(yè)科學院獸醫(yī)研究所 農業(yè)部動物疫病診斷與免疫重點開放實驗室 國家獸用生物制品工程技術研究中心，南京 210014）

沙門氏菌病是由不同種沙門氏菌引起不同宿主疾病的總稱，可以誘發(fā)動物的傷寒、副傷寒、腹瀉、流產等疾病以及人的腹瀉、傷寒、敗血癥、食物中毒、副傷寒等[1]。沙門氏菌屬于腸道桿菌，在人畜公共衛(wèi)生方面具有十分重要的意義[2-3]。根據(jù)調查顯示，全世界范圍內的食物中毒病例中以沙門氏菌為誘因的占據(jù)前而位[4-6]。在我國由于加工食品攜帶沙門氏菌而引起食物中毒的病例占首位[7-10]。沙門氏菌病被發(fā)現(xiàn)至今，主要依靠抗生素類藥物治療和預防，尤其是20世紀中期，抗生素被大量濫用，耐藥菌株不斷出現(xiàn)，已經成為全世界亟待解決的公共衛(wèi)生問題之一。目前，針對禽源和人源沙門氏菌的研究較多，對于家兔沙門氏菌病的研究與報道相對較少。我國是兔肉生產與出口的第一大國，家兔沙門氏菌病的發(fā)生和流行，不僅會帶來嚴重的公共衛(wèi)生安全問題，也會給家兔產業(yè)帶來巨大的經濟損失。

2016年2～5月，山東某兔場發(fā)生腸炎沙門氏菌病[11]。2017年2月份開始，該兔場又出現(xiàn)母兔發(fā)生流產、死亡，新生仔兔、幼兔死亡的臨床現(xiàn)象，剖檢以脾臟腫大為特征病變，使用多種藥物都未起到明顯效果。基于此疫情，我們對該兔場和周邊兔場進行了流行病學調查并制備了疫苗進行預防接種。結果顯示：通過對大量樣本檢測，我們篩選出一套快速、準確的兔腸炎沙門氏菌檢測法；分離菌株為ST.11序列型，存在較強的耐藥性；疫苗免疫可以較好地防控腸炎沙門氏菌病再次發(fā)生。本研究為腸炎沙門氏菌病的臨床診斷和流行病學調查提供了有效方法，為腸炎沙門氏菌病的防控提供了實用性方案。

1 材料與方法

1.1 樣本 山東某兔場（甲兔場）繁殖母兔的新鮮糞便和乳汁、流產死胎、兔舍環(huán)境樣本、飼料、水源；分兔場（乙兔場）繁殖母兔的新鮮糞便、流產死胎；山東省其他兔場（丙兔場）繁殖母兔的新鮮糞便。

1.2 培養(yǎng)基與主要試劑 改良馬丁肉湯培養(yǎng)基、0.1%無菌蛋白胨水溶液（BPW）、膽硫乳瓊脂（DHL）、三糖鐵瓊脂、四硫磺酸鹽煌綠增菌液基礎（TTB）、亞硫酸鉍瓊脂（BS）、氯化鎂孔雀綠肉湯（MM）和亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）均購自青島高科園海博生物科技有限公司，抗菌藥物藥敏紙片、細菌微量生化反應管購自杭州微生物試劑有限公司，Taq酶購自TaKaRa公司，細菌基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司，其余試劑均為國產分析純。

1.3 引物 引物均由南京擎科生物科技有限公司合成。

1.3.1 腸炎沙門氏菌特異性引物 Usef A-F：5'-ATG CGTAAATCAGCATCTG-3'；Lsef A-R：5'-TTAGT TTTGATACTGCTGAAC-3'。

1.3.2 MLST分型反應引物[12]針對腸炎沙門氏菌的分型有7對特異性引物，包括hisD、aroC、hemD、sucA、dnaN、purE、thrA（表1）。

表1 用于MLST分型的引物Table 1 Primers used for MLST

1.4 臨床調查和取樣 詢問發(fā)病兔場既往病史、發(fā)病情況、藥物使用情況，對病死兔進行臨床解剖、觀察和取樣，采集新鮮的糞便和乳汁；對兔場周邊環(huán)境進行調查取樣，包括兔籠、兔舍、周轉箱、飼料、水源等。

1.5 沙門氏菌選擇性培養(yǎng)[13]

1.5.1 預增菌 將無菌采集的樣品接種于5 mL的BPW中，37℃培養(yǎng)18～24 h。

1.5.2 選擇性增菌 從培養(yǎng)后的BPW中吸取500 μL，分別接種于TTB、MM、SC三種選擇性增菌液中，增菌液各5 mL，MM與SC放置37℃培養(yǎng)18～24 h，TTB放置42℃ 培育18～24 h。

1.5.3 分離培養(yǎng) 用接種環(huán)將菌液分別劃線接種于DHL平板和BS平板，DHL平板放置37℃培育22～24 h，BS平板放置37℃培育40～48 h，觀察單菌落形態(tài)特征。

1.6 生化特性 根據(jù)國家檢測標準《食品衛(wèi)生微生物學檢驗-沙門氏菌檢驗》[14]，用改良馬丁肉湯對疑似沙門氏菌單菌落培養(yǎng)，并進行生化特性分析，分別接種于三糖鐵瓊脂斜面、硫化氫、靛基質、尿素、氰化鉀、賴氨酸脫羧酶、甘露醇、ONPG等微量生化反應管，37℃ 培養(yǎng)24 h，觀察并記錄。

1.7 腸炎沙門氏菌特異性PCR鑒定與序列測定 對疑似沙門氏菌單菌落進行菌落PCR鑒定，以腸炎沙門氏菌作為陽性對照，以陰性菌株為陰性對照，以蒸餾水為空白對照。反應體系：2×Mix 10.0 μL，上下游引物各0.5 μL，挑取單菌落，加dd H2O至總體積20.0 μL。反應條件：95℃ 預變性4 min；95℃變性15 s，52℃ 退火30 s，72℃ 延伸40 s，30個循環(huán)，72℃ 延伸1 min。用1%的瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳鑒定，電壓120V，時間30 min，用凝膠成像系統(tǒng)處理圖像，切膠回收目的片段，送南京擎科生物科技有限公司測序。

1.8 MLST分型[15]對從甲兔場、乙兔場和丙兔場糞便分離的3株腸炎沙門氏菌進行MLST分型比較試驗。提取細菌基因組DNA，用7個管家基因所對應的特異性引物進行PCR擴增，反應體系：Taq酶0.5 μL，10×PCR buffer 5.0 μL，dNTP 4.0 μL，上下游引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，加ddH2O至總體積50.0 μL。反應條件：94℃ 預變性4 min；94℃ 變性30 s，55℃ 退火30 s，72℃ 延伸1 min，30個循環(huán)，72℃ 延伸4 min。用1%的瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳鑒定，將鑒定為陽性的產物送往南京擎科生物科技有限公司進行測序，運用DNAMAN軟件進行序列結果比對，分別將7對序列輸入MLST數(shù)據(jù)庫（https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_mlst_seqdef&set_id=2&page=profiles&scheme_id=2），并對序列型進行分析。

1.9 藥敏試驗 分別取來自3個兔場分離的4株腸炎沙門氏菌培養(yǎng)物100 μL均勻涂布于馬丁平板，選取14種藥敏試紙片貼于平板內，37℃培養(yǎng)24 h。根據(jù)抑菌圈直徑判斷耐藥性。抑菌圈直徑大于15 mm為高度敏感；直徑大于10 mm且小于15 mm為中度敏感；直徑小于10 mm為不敏感或耐藥。

1.10 疫苗免疫預防 針對甲兔場的發(fā)病情況，用分離菌在本實驗室自制滅活疫苗，對兔場母兔進行一次免疫和兩次免疫試驗。一次免疫的母兔，免疫2 mL/只；兩次免疫的母兔，首免2 mL/只，間隔2周進行二次免疫，1 mL/只。在首次免疫后1個月內，觀察新生仔兔死亡率；每隔兩周采取新鮮糞便進行腸炎沙門氏菌檢測，并統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 臨床調查和取樣 山東某兔場（甲兔場）于2017年2月份開始發(fā)病，病情與2016年相似[11]，以兩幢兔舍（A舍、B舍）病情最為嚴重。11日齡新生仔兔死亡率突然升高；每幢兔舍約900只種兔，仔兔數(shù)量約7000余只，每日仔兔正常死亡數(shù)應在10只以內，突然升高至50只以上，嚴重時段達100只以上，使用阿奇霉素、安普霉素、替米考星等藥物效果不明顯；部分懷孕母兔出現(xiàn)流產、死亡現(xiàn)象，陰道黏膜紅腫，有膿性分泌物流出，病理剖檢以脾臟腫大為主，其他實質性器官未發(fā)現(xiàn)明顯肉眼可見病變（圖1）。

圖1 臨床癥狀Fig.1 Clinical symptoms

2.2 選擇性培養(yǎng)研究 采集樣品經預增菌后于選擇性增菌液TTB、MM、SC中培養(yǎng)后，接DHL平板和BS平板培養(yǎng)，DHL平板上的陽性沙門氏菌菌落為無色半透明菌落，有黑色中心或幾乎全部為黑色，有些菌株無黑色中心；BS平板上的陽性菌落呈棕褐色或灰色，有金屬光澤，有些菌株形成灰綠色菌落。經分析比較，MM選擇性增菌液的陽性檢出率要明顯低于TTB和SC（表2）。

2.3 生化特性 沙門氏菌分離菌生化試驗檢測結果顯示，所有分離菌均符合腸炎沙門氏菌的生化特性（表3）。

表2 沙門氏菌檢出率Table 2 Positive rates of Salmonella

表3 生化檢測結果Table 3 Results of biochemical test

2.4 腸炎沙門氏菌特異性PCR鑒定 用腸炎沙門氏菌特異性引物對疑似沙門氏菌單菌落進行PCR擴增。結果顯示，擴增出的基因片段大小為498 bp，與目的基因片段大小相同（圖2），序列測定結果與目的序列一致，可以判定本次沙門氏菌病的病原體為腸炎沙門氏菌。

圖2 菌落PCR結果Fig.2 Results of bacterial colony PCR

2.5 不同樣品檢測結果 兔場的糞便檢測均有陽性，其中甲兔場的A舍糞便檢出率相對較高，達到73.33%；乳汁中也檢測到腸炎沙門氏菌的存在，流產死胎的陽性檢出率100%，在兔舍環(huán)境樣本、飼料和水源中未檢測到腸炎沙門氏菌。

表4 不同種類樣品腸炎沙門氏菌陽性率Table 4 Positive rates of Salmonella Enteritidis indifferent sorts of samples

2.6 MLST分型 對從甲兔場、乙兔場和丙兔場糞便分離的3株腸炎沙門氏菌進行MLST分型比較試驗并進行分析。結果顯示，甲兔場、乙兔場和丙兔場菌株為同一序列型，都是ST.11（圖3、表5）。

2.7 藥敏試驗 對分離的4株腸炎沙門氏菌進行藥敏試驗。結果顯示，分離菌株對青霉素、鏈霉素、氨芐西林、四環(huán)素和多西環(huán)素的耐藥性最高，對頭孢噻肟、丁胺卡那和氟苯尼考的敏感性最高。細菌多重耐藥現(xiàn)象嚴重（表6）。

圖3 MLST分型方法中7個看家基因的PCR結果Fig.3 PCR products of 7 housekeeping genes in MLSTM: DNA分子量標準(DL2000); A: 甲兔場菌株; B: 乙兔場菌株; C:丙兔場菌株. 泳道1～7, 8～14, 15～21對應的看家基因依次為hisD,aroC, hemD, sucA, dnaN, purE, thrAM: DNA Marker(DL2000); A: Warren A; B: Warren B; C: Warren C. Lane 1-7, 8-14, 15-21 corresponds to housekeeping genes are hisD, aroC, hemD, sucA, dnaN, purE, thrA, respectively

表5 MLST分型結果Table 5 Results of MLST

表6 藥敏試驗結果（單位：mm）Table 6 Results of drug susceptibility test (unit: mm)

2.8 疫苗免疫效果 經疫苗免疫后，甲兔場的病情得到有效控制。新生仔兔死亡率明顯降低，腸炎沙門氏菌陽性檢出率明顯下降。兩次免疫效果優(yōu)于一次免疫效果（表7）。

表7 免疫前后腸炎沙門氏菌檢出率Table 7 Detection rates of Salmonella Enteritidis pre- and post- immunization

3 討論

通過對大量樣品的檢測與數(shù)據(jù)分析，本研究篩選出一套快速、準確的兔腸炎沙門氏菌實驗室檢測法。對3種選擇性增菌液的陽性檢出率進行比較，其中，TTB和SC選擇性增菌液的陽性檢出率相同，MM選擇性增菌液的陽性檢出率較低，與孔繁德[13]之前的研究報告基本相符。在后期大量樣品檢測試驗中，我們淘汰了MM選擇性增菌液，對選擇性增菌液TTB和SC，我們同時使用或二者選其一，提高試驗效率，結合相關生化試驗和特異性菌落PCR鑒定，可以用于臨床上大批量樣品的檢測，效果良好。利用優(yōu)化后的方法對甲兔場、乙兔場和丙兔場進行流行病學調查，對分離菌株進行藥敏試驗和MLST分型比較。檢測結果表明，不同兔場糞便陽性細菌檢出率分別為73.33%、40.00%、30.30%、31.25%，說明家兔發(fā)病期間，普遍通過腸道途徑向外排出病原；分離菌株呈現(xiàn)嚴重的多重耐藥性，且不同兔場間的耐藥情況差異明顯，推測與各兔場抗生素使用的情況有關；3個兔場的沙門氏菌分離菌株經分型比較結果顯示，菌株均為ST.11序列型，推測可能該類型菌有較強的傳播能力，在當?shù)爻实胤叫粤餍谢蛘吣竿脕碓从谕粋€種兔場；新鮮乳汁、死亡仔兔和死胎中也檢測到腸炎沙門氏菌，說明腸炎沙門氏菌病可以通過胎盤垂直傳播，在禽沙門氏菌病的傳播途徑中，通過蛋垂直傳播為主。

沙門氏菌病屬于人獸共患病，危害嚴重。由于多年來大規(guī)模使用抗生素治療沙門氏菌病，沙門氏菌的耐藥問題日益嚴重。因此，科學合理的預防尤為重要。本次發(fā)病兔場使用多種抗生素，治療效果不明顯。在使用自制滅活疫苗進行一次免疫和兩次免疫后，病情得到有效控制。而且兩次免疫效果優(yōu)于一次免疫效果，說明對沙門氏菌病的防控，疫苗免疫相對于抗生素的治療，更具優(yōu)勢。

本次發(fā)病兔場的規(guī)?；潭雀?、管理制度系統(tǒng)完整、日常消毒安排合理，但仍出現(xiàn)嚴重的沙門氏菌感染。這種情況除了與沙門氏菌自身生存能力強、易感染外，說明兔場可能在日常管理、消毒過程中仍存在一定盲點。要徹底消除此病，兔場還需加強對外來引進種兔的病原監(jiān)測力度，實行嚴格的糞污處理措施，制定合理的免疫防控計劃等，最終達到凈化此病的目標。