周婷婷

在《中國(guó)藥典》2015年版一部中記載的臨床常用烏頭類中藥包括：毛茛科植物烏頭(Aconitum carmichaeli)的干燥母根，草烏為毛茛科植物烏頭、北烏頭等多屬植物的塊根，附子為毛茛科植物烏頭的子根的加工品及其多種炮制加工品[1]。三者均為國(guó)家法定品種，是有毒中藥大毒、有毒、小毒的代表[2]。烏頭類中藥在我國(guó)已有2000多年的應(yīng)用歷史，國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)道也較多，主要集中在酯型生物堿成分的含量測(cè)定和藥理毒理上[3-6]，但對(duì)于其蛋白質(zhì)的化學(xué)研究鮮有報(bào)道。

近年來(lái)，隨著人們對(duì)蛋白質(zhì)、多肽物質(zhì)的認(rèn)識(shí)，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)除了作為人體的必需生命物質(zhì)以外，還有一些特殊的藥理作用[7-9]。同時(shí)現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)中草藥中的氨基酸往往是治療疾病的主要有效成分或輔助成分[10-12]。由于烏頭類中藥中蛋白質(zhì)的含量也較高，而且在臨床常用溶媒（水和酒）中的溶解度也較高。因此，本論文以酸水解得到氨基酸為指標(biāo)進(jìn)行分析，以氨基酸的種類和含量對(duì)烏頭類藥材進(jìn)行對(duì)比研究，旨在找出它們?nèi)咴诎被峤M成方面的差異，為烏頭類藥材的現(xiàn)代研究提供一定的參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材來(lái)源

生川烏、生附子（均采自四川江油附子GAP基地），生川烏購(gòu)買于四川省中藥材公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室李敏教授鑒定，均為正品。

1.2 主要儀器

日立L-8800型氨基酸自動(dòng)分析儀（ASM自動(dòng)數(shù)據(jù)處理器）；DGG-9240A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器廠）；Satorius BP211D電子分析天平（萬(wàn)分之一）；Waters水解工作臺(tái)；BUG超聲波清洗儀（上海森信儀器廠）；HGC-12氮吹儀（上海泉島科貿(mào)有限公司）；pH S-2型酸度計(jì)（上海雷磁儀廠）等。

1.3 試劑

乙醇、茚三酮、氫氧化鋇、硫酸銨、鹽酸等試劑均為分析純，氨基酸對(duì)照品（日立提供配套分析用）。實(shí)驗(yàn)室水為重蒸水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品處理

將川烏、草烏、生附子分別粉碎為細(xì)粉（過(guò)60目篩），精密稱量川烏、草烏、生附子粉末各50.5 mg、50.1 mg、49.8 mg。將粉末置于特制的玻璃水解管中真空干燥后，加入6.0 mol/L HCl溶液，將試管置于反應(yīng)器中，超聲脫氣10 min，再抽至真空并充入氮?dú)夥磸?fù)3次后110 ℃恒溫24 h進(jìn)行酸水解。將酸水解的樣品溶液減壓干燥（-0.7 Mpa，70 ℃），由于儀器要求，用0.1 mol/L的HCl溶液溶解并定容于5 mL量瓶中，用0.45 μm濾膜過(guò)濾。分別進(jìn)樣20 μL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 測(cè)定條件

離子交換柱：柱長(zhǎng)4.6*60 mm，樹脂2622#，反應(yīng)柱柱溫135 ℃；分離柱柱溫 57 ℃。緩沖液：流速0.40mL/min；柱壓7.00～7.30 Mpa；茚三酮：流速0.35 mL/min，柱壓0.70～0.80 Mpa。采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白分析程序。

2.3 分析數(shù)據(jù)

ASM水解蛋白標(biāo)準(zhǔn)分析法。

2.4 數(shù)據(jù)處理

ASM自動(dòng)數(shù)據(jù)處理器。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 種類差別

采用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定了烏頭類藥材中氨基酸組分，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)酸水解的草烏、川烏、生附子水解樣品液中均能夠檢測(cè)出16種氨基酸，而且3種樣品中都沒有檢測(cè)出脯氨酸。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看氨基酸峰的數(shù)目基本一致，而且其他未檢測(cè)的雜質(zhì)峰的保留時(shí)間也僅僅是個(gè)別差異，這就說(shuō)明了草烏、川烏、生附子的氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽的組成極為相似。

3.2 量的差別

整體上水解氨基酸的總量是生附子＞生草烏＞生川烏，生草烏與生川烏水解氨基酸的含量比較接近。在個(gè)體上生附子絕大多數(shù)水解氨基酸的含量較高，這也提示其蛋白質(zhì)相對(duì)較多。所含氨基酸中以谷氨酸含量最高，生附子中為106.5370 nmol/50g生藥，生草烏中為97.4868 nmol/50g生藥，生川烏中為38.1867 nmol/50g生藥。但是精氨酸的含量在川烏中的含量比生附子高，而生川烏的纈氨酸含量與生附子和生草烏相差巨大，有可能是其對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的含量極小造成的，詳細(xì)結(jié)果見表1。

通過(guò)測(cè)定，可以看出草烏、川烏、生附樣品中含有人體必需的氨基酸：賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸，其必需氨基酸的總量是生附子＞生草烏＞生川烏，與氨基酸含量規(guī)律一致。

表1 草烏、川烏、生附樣品中含各類氨基酸的量(nmol/50g生藥)

4 討論

氨基酸分析技術(shù)在生命科學(xué)、食品科學(xué)、中醫(yī)藥學(xué)等領(lǐng)域研究中都起著至關(guān)重要的作用。近年來(lái)，人們?cè)絹?lái)越重視氨基酸分析方法的革新和改進(jìn)，氨基酸分析的速度、靈敏度、儀器自動(dòng)化水平提高至一個(gè)嶄新的水平，使氨基酸分析方法發(fā)展成為一種具有廣泛適應(yīng)性的分析方法。實(shí)驗(yàn)中選擇全自動(dòng)氨基酸分析儀對(duì)氨基酸進(jìn)行測(cè)定，是利用樣品中氨基酸組分的結(jié)構(gòu)不同、酸堿性、極性及分子大小不同，在陽(yáng)離子交換柱上將它們分離，采用不同pH值離子濃度的緩沖液將各氨基酸組分依次洗脫下來(lái)，再逐個(gè)以另一流路的茚三酮試劑混合，然后共同流至螺旋反應(yīng)管中，于一定溫度下進(jìn)行顯色反應(yīng)，形成在570nm有最大吸收的藍(lán)紫色產(chǎn)物。該方法操作步驟簡(jiǎn)單，氨基酸不用柱前衍生，直接上樣進(jìn)行分析，故是迄今氨基酸定性、定量分析中應(yīng)用最廣泛的方法之一。同時(shí)該方法也是目前多種中藥中氨基酸測(cè)定的常用方法[13-15]。

烏頭類中藥通過(guò)酸水解后進(jìn)行氨基酸分析尚未有文獻(xiàn)報(bào)道，我們?cè)谒膺^(guò)程中經(jīng)過(guò)反復(fù)嘗試發(fā)現(xiàn)：在水解之前必須要將樣品中和酸水中的空氣排除完全后再吹入氮?dú)?，否則殘留的空氣會(huì)氧化含有羥基的氨基酸，如蘇氨酸、絲氨酸、酪氨酸，使之無(wú)法檢出。

因?yàn)樗獍被嵝枰?.0 mol/L HCl溶液對(duì)藥材進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的高溫作用，會(huì)對(duì)藥材產(chǎn)生類似炮制加工的作用，所以在實(shí)驗(yàn)中僅選用生品進(jìn)行分析比較。在衍生步驟中我們前期通過(guò)考察茚三酮法、OPA法、PTC-AA法，最后采用靈敏度高、簡(jiǎn)便可靠的茚三酮法。但是茚三酮試劑必須在避光的真空環(huán)境中進(jìn)行儲(chǔ)存。

傳統(tǒng)烏頭類藥材常以水煎入藥，長(zhǎng)期以來(lái)研究者們重點(diǎn)關(guān)注的都是生物堿類成分，而總生物堿的含量在該類藥材中的含量不到1%[16]。水煎液中含有大量的大極性成分，近年來(lái)關(guān)于其水溶性成分多糖的研究日益增多[17-18]，而對(duì)另一類活性物質(zhì)蛋白質(zhì)、氨基酸類成分關(guān)注甚少。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)，烏頭類藥材中含有豐富的蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸類成分，且附子中含量更為豐富，這與植物代謝過(guò)程中的積累程度有著密切的關(guān)系。同時(shí)，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究，也填補(bǔ)了烏頭類藥材氨基酸類成分研究的空白，為烏頭類藥材的現(xiàn)代研究提供一定的參考。