舒姮，毛知娟，楊勇，周燕，葉卉

翠云草（Selaginella uncinata (Desv.) spring）是卷柏科卷柏屬植物，又名藍(lán)地柏、綠絨草、金雞鳳尾草，主要在我國廣東、廣西、云南、貴州等南方地區(qū)分布。翠云草為民間習(xí)用藥，植物全草均可藥用，具有清熱解毒、消瘀、止血、利濕等功效[1～2]。研究發(fā)現(xiàn)翠云草中的黃酮類物質(zhì)豐富，主要含有穗花杉雙黃酮、羅波斯塔雙黃酮、羅波斯塔-4＇-甲醚和2″，3″-二氫-4-甲氨基穗花杉雙黃酮等[3]。有研究發(fā)現(xiàn)翠云草的總黃酮（total flavones of Selaginella uncinata（Desv.）spring，TFS ）具有抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的作用[4]。但翠云草的黃酮類物質(zhì)對肺癌細(xì)胞的生長是否具有抑制效應(yīng)未見報(bào)道。本研究通過TFS作用于肺癌A549細(xì)胞和H460細(xì)胞，觀察其對肺癌細(xì)胞生長的影響和作用機(jī)理，為翠云草抗腫瘤活性的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

翠云草購于四川省荷花池中藥材市場；A549細(xì)胞、H460細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）、DMEM高糖培養(yǎng)基（GIBCO公司）、胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）、CCK8試劑盒與細(xì)胞周期檢測試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑（碧云天生物技術(shù)有限公司）；兔源ERK抗體、兔源

p-ERK抗體、兔源GAPDH抗體、羊抗兔多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；無水乙醇等分析純試劑（成都科龍化工試劑）。酶標(biāo)儀（FC，Thermo），流式細(xì)胞儀（CytoFLEX，Beckman），蛋白檢測成像系統(tǒng)（Chemi Doc，BIO-RAD）。

1.2 方法

1.2.1 翠云草總黃酮制備…取翠云草藥材1000 g，粉碎成粗粉后過 60 目篩，用60%乙醇加熱提取 20 min，提取 2 次，合并濾液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后烘干至恒重， AB - 8 大孔吸附樹脂純化，70% 乙醇洗脫、富集，濃縮干燥得到翠云草提取物。以蘆丁為對照品，提取物用甲醇溶解，酶標(biāo)儀下進(jìn)行掃描；提取物在 510 nm 有最大吸收峰，吸收光譜與蘆丁相似，故翠云草提取物含有黃酮類物質(zhì)。以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品測定吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 根據(jù)回歸方程計(jì)算出翠云草總黃酮的含量為 2.68 mg．g-1。翠云草總黃酮以DMSO溶解，配制成濃度為 1 mg．mL-1的溶液 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及檢測…A549細(xì)胞和H460細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，青霉素100 IU．mL-1，鏈霉素IU．mL-1）于37 ℃、5% CO2常規(guī)培養(yǎng)。（1）細(xì)胞增殖檢測：取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以每孔5千個(gè)的密度接種到96孔培養(yǎng)板中，24 h后加入終濃度為5～40 μg．mL-1的TFS，每個(gè)濃度6個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置DMSO對照組；于加藥后的24、48、72 h加入CCK8試劑，酶標(biāo)儀450 nm處下測定吸光度值并計(jì)算生長抑制率。抑制率=（OD對照組-OD藥物組）/OD對照組×100%。（2）細(xì)胞周期檢測：取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以每孔10萬個(gè)的密度接種到6孔培養(yǎng)板中，24 h后加入終濃度為10、20 μg．mL-1的TFS；加藥24 h后消化離心收集細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞周期檢測試劑盒的操作流程操作并于細(xì)胞流式儀檢測分析細(xì)胞周期。（3）ERK蛋白和p-ERK蛋白檢測：取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以每孔10萬個(gè)的密度接種到6孔培養(yǎng)板中，24 h后加入終濃度為10 μg．mL-1和20 μg．mL-1的TFS；加藥24 h后收集細(xì)胞，采用RAPI裂解液提取蛋白總蛋白，SDS-PAGE電泳，對蛋白進(jìn)行電轉(zhuǎn)移（200 mA，50 min）并切割目的條帶，目的條帶分別用ERK抗體、p-ERK抗體、GAPDH抗體4℃孵育過夜，羊抗兔多克隆抗體室溫孵育2 h，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑后于蛋白檢測成像系統(tǒng)檢測目的蛋白。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析…以三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，以雙尾α=0.05的水準(zhǔn)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖檢測

TFS作用于肺癌A549細(xì)胞和H460細(xì)胞后，細(xì)胞的生長均受到抑制，抑制的效果隨著TFS濃度的增加和作用時(shí)間的增長而增強(qiáng)。見圖1。

圖1 TFS對A549細(xì)胞和H460細(xì)胞生長的影響

2.2 細(xì)胞周期檢測

TFS作用于肺癌A549細(xì)胞后，使細(xì)胞阻滯于G0/G1期；與對照組相比，兩個(gè)TFS組的周期分布差異顯著（P＜0.05）。作用于H460細(xì)胞后，使細(xì)胞阻滯于S期和G2/GM期；與對照組相比，兩個(gè)TFS組的周期分布差異顯著（P＜0.05）。與對照組相比，兩種細(xì)胞中，DMSO對細(xì)胞的周期分布均無明顯改變（P＞0.05）。在兩種細(xì)胞中，TFS的劑量為10 μg．mL-1時(shí)與20 μg．mL-1時(shí)的細(xì)胞周期分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2和圖3。

圖2 TFS對A549細(xì)胞周期的影響

圖3 TFS對H460細(xì)胞周期的影響

2.3 ERK蛋白和p-ERK蛋白檢測

TFS作用于肺癌A549細(xì)胞和H460細(xì)胞后，降低了p-ERK的表達(dá)水平；此外，TFS還降低了H460細(xì)胞中ERK總蛋白的表達(dá)（P＜0.05），但對A549細(xì)胞中ERK總蛋白的表達(dá)影響不顯著（P＞0.05）。在兩種細(xì)胞中，TFS的劑量為10 μg．mL-1時(shí)與20 μg．mL-1時(shí)對總ERK蛋白和p-ERK蛋白的改變無顯著差異（P＞0.05）。

圖4 TFS對ERK蛋白表達(dá)的影響

3 討論

惡性腫瘤在我國是致死性位居第二的疾病，其中肺癌的發(fā)病率和死亡率也在逐漸增加，已成為我國發(fā)病率最高的惡性腫瘤，每年約有700萬人診斷為肺癌，600萬人死于肺癌[5]。化學(xué)藥物治療是肺癌的主要治療手段之一，但目前已在臨床治療中的藥物在治療過程中會出現(xiàn)藥物耐受而降低治療效果；開發(fā)新的藥物是解決該問題的方法之一。我國藥物資源豐富，從中草藥中挖掘開發(fā)治療腫瘤的藥物不僅有助于腫瘤的臨床治療，也有助于夯實(shí)中藥在現(xiàn)代臨床治療中的作用。

翠云草為卷柏科卷柏屬植物，在南方廣泛分布，具有清熱解毒、利濕通絡(luò)、化痰止咳、止血生肌等功效，內(nèi)服和外用均可，在一些少數(shù)民族地區(qū)也有用于治療腫瘤的臨床應(yīng)用。翠云草的主要活性物質(zhì)為黃酮類化合物[6～8]，但對其黃酮類物質(zhì)抗腫瘤活性的研究報(bào)道極少，僅有孫楨楨等人[4]的研究發(fā)現(xiàn)翠云草的總黃酮可能通過降低結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中環(huán)氧化酶COX-2的mRNA和蛋白的表達(dá)而發(fā)揮其抗腫瘤的效應(yīng)。而明確翠云草黃酮類物質(zhì)抗腫瘤的機(jī)制有助于翠云草活性物質(zhì)在臨床中的開發(fā)利用。

惡性腫瘤細(xì)胞最基本的生物學(xué)特征是失控性增殖；細(xì)胞失控性增殖的生物學(xué)基礎(chǔ)是細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，這種紊亂通常與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的重要信號通路調(diào)控失常有關(guān)；在多種腫瘤細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)有調(diào)控細(xì)胞生長增殖的信號異?；罨Ｗ鳛榻z裂原活化蛋白激（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的主要信號通路之一的 Ras/Raf/MEK/ERK信號通路是調(diào)控細(xì)胞生長、分化、凋亡等的主要信號通路之一，胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）是該通路中的末端信號傳遞者，被上游的MEK磷酸化而激活后調(diào)節(jié)其他激酶或轉(zhuǎn)錄因子的活化進(jìn)而調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)ERK的高表達(dá)在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展中起了重要的促進(jìn)作用[9]；ERK通路在肺腺癌形成早期階段已被激活，使癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等能力增強(qiáng)[10]；在肺癌患者的癌細(xì)胞中p-ERK的陽性表達(dá)率可高達(dá)70%[11～12]；抑制ERK通路的活性可能抑制腫瘤細(xì)胞生長，ERK信號通路已成為腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，翠云草總黃酮對肺癌A549細(xì)胞和H460細(xì)胞的生長具有抑制作用，對兩種細(xì)胞的周期進(jìn)程均具有干擾，使A549細(xì)胞阻滯于G0/G1期和H460細(xì)胞阻滯于S期和G2/GM期；細(xì)胞周期進(jìn)程的變緩或停滯則使細(xì)胞的生長增殖變緩。此外，翠云草總黃酮使A549細(xì)胞中ERK的活化水平降低，即p-ERK的表達(dá)降低；而使H460細(xì)胞中ERK總蛋白的表達(dá)和其活化水平均降低。以上結(jié)果表明，翠云草總黃酮對肺癌A549細(xì)胞和H460細(xì)胞的生長具有抑制作用，使細(xì)胞的周期進(jìn)程停滯變緩，這種抑制作用可能與其降低ERK 信號通路的活性有關(guān)。而何種因子參與了該信號的上游調(diào)控以及何種下游基因發(fā)揮了抑癌效應(yīng)則需要進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。本研究提示翠云草具有抑制肺癌細(xì)胞生長的潛能。