封 琦，胡春風，洪奧博，薛 松，嵇 元，王 權(quán)

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院 水產(chǎn)科技學院，江蘇 泰州 225300 )

亞硝態(tài)氮作為氮循環(huán)中氨態(tài)氮向硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化的中間產(chǎn)物，廣泛存在于水生態(tài)系統(tǒng)中。相對于陸生動物，魚類受亞硝態(tài)氮影響較大，這是因為魚鰓上皮細胞可以自周圍水體中主動吸收亞硝態(tài)氮，并累積在體液中。亞硝態(tài)氮主要影響魚體的離子調(diào)節(jié)、呼吸、心血管、內(nèi)分泌以及排泄功能[1]。精養(yǎng)體系(主要是水體交換量很少的靜水和循環(huán)水模式)中，亞硝態(tài)氮的累積會對養(yǎng)殖對象產(chǎn)生應激作用，造成生長緩慢乃至大量死亡[2-5]。

中華鳑鲏(Rhodeussinensis)是我國(除黑龍江水系外)廣泛分布的淡水魚類，本身具有較高的觀賞價值[6]，同時可以與其他水產(chǎn)經(jīng)濟動物混養(yǎng)以提高經(jīng)濟效益[7-10]，而且可對養(yǎng)殖水體環(huán)境變化進行生物預警[11-13]。筆者以中華鳑鲏為研究對象，對亞硝態(tài)氮急性毒性及短期脅迫條件下，中華鳑鲏血清中過氧化氫酶和堿性磷酸酶的活性變化進行研究，旨在為中華鳑鲏生態(tài)套養(yǎng)模式中的水質(zhì)管理提供科學建議。

1 材料與方法

1.1 材料

中華鳑鲏取自江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院水產(chǎn)實訓中心，試驗前暫養(yǎng)于1.0 m×0.6 m×0.5 m的水族缸中兩周。試驗期間，正常投喂配合飼料，每日虹吸清除底部殘渣，水溫(25±1) ℃，pH 7.4±0.1，溶解氧(6.3±0.6) mg/L。挑選健康、活躍個體[體質(zhì)量(0.636±0.09) g，體長(3.9±0.39) cm]用于試驗。

過氧化氫酶測定試劑盒、堿性磷酸酶測定試劑盒(南京建成生物科技有限公司)，NaNO2為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗設計

采用靜水法進行急性毒性測試，在預試驗的基礎上，設置6個質(zhì)量濃度組(6、10、11、14、16.6、18 mg/L)和1個空白對照組，每組3個平行。不同質(zhì)量濃度的測試液均采用超純水(pH約7.4)添加適量NaNO2制備而成，每組水量10 L。每個質(zhì)量濃度組隨機加入20尾活力良好的中華鳑鲏，24 h后計數(shù)死亡個體數(shù)。

根據(jù)急性毒性試驗結(jié)果，設置高、中、低3個處理組，分別為24 h 半致死質(zhì)量濃度的1/10、1/20、1/30，每個處理組設3個平行，保持試驗期間水中亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度穩(wěn)定；在0(試驗開始前)、24、48、72 h 4個時間點各隨機取出5尾，采用1 mL無菌注射器圍心腔取血，合并置于無菌離心管中，3500 r/min離心10 min, 取上層血清，立即測定過氧化氫酶、堿性磷酸酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

急性毒性數(shù)據(jù)采用概率單位法分析；對酶活性數(shù)據(jù)先進行Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗和Levene′s方差齊性檢驗；當上述條件均滿足后，采用雙因素方差分析因子主效應(固定因子為亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度和暴露時間)，對交互作用進行簡單效應分析[14]；若未滿足上述參數(shù)統(tǒng)計檢驗條件(數(shù)據(jù)正態(tài)性和方差齊性)，則先進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換[15]；若實在無法滿足參數(shù)統(tǒng)計條件(數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后，仍無法滿足上述參數(shù)檢驗條件)，則運用Dunnett′s C非參數(shù)檢驗進行多重比較，所有計算均采用統(tǒng)計軟件SPSS 24.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞硝態(tài)氮對中華鳑鲏的急性毒性

試驗中觀察到魚狂躁不安，出現(xiàn)體表充血、死亡現(xiàn)象。根據(jù)24 h急性毒性試驗結(jié)果(表1)，計算得到亞硝態(tài)氮對中華鳑鲏24 h半致死質(zhì)量濃度為12.76 mg/L。

表1 亞硝態(tài)氮對中華鳑鲏的急性毒性效應試驗結(jié)果

2.2 亞硝態(tài)氮對中華鳑鲏血清過氧化氫酶活性的影響

雙因素方差分析結(jié)果表明，亞硝態(tài)氮暴露時間對過氧化氫酶活性作用影響極顯著，并且亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度和暴露時間兩者間存在極顯著的交互作用。因亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度對過氧化氫酶活性作用影響不明顯，后期簡單效應分析僅檢測在不同亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度水平上的暴露時間效應。3個質(zhì)量濃度組過氧化氫酶活性變化大致相同，隨著暴露時間延長均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在第48 h過氧化氫酶活性達到峰值(顯著高于各自對照組)，并且隨著亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度增加而升高(圖1)。

圖1 亞硝態(tài)氮對中華鳑鲏血清過氧化氫酶活性的影響圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05).下同.

2.3 亞硝態(tài)氮對中華鳑鲏血清堿性磷酸酶活性的影響

數(shù)據(jù)預處理發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶活性數(shù)據(jù)還缺方差齊性條件，對數(shù)轉(zhuǎn)換后可以滿足參數(shù)統(tǒng)計條件，因此后續(xù)統(tǒng)計分析中均采用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)。雙因素方差分析結(jié)果表明，亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度和暴露時間均會對堿性磷酸酶活性造成極顯著的影響，并且兩因素之間存在極顯著的交互作用。3個質(zhì)量濃度組堿性磷酸酶活性在24 h均顯著下降，在48 h呈回升趨勢，此后在72 h再次明顯下降(圖2a)。在24 h堿性磷酸酶活性亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度升高呈顯著下降趨勢，在72 h 0.64、1.28 mg/L組酶活性均顯著低于0.43 mg/L組(圖2b)。

圖2 亞硝態(tài)氮對中華鳑鲏血清堿性磷酸酶活性的影響

3 討 論

3.1 亞硝態(tài)氮對中華鳑鲏的急性毒性

亞硝態(tài)氮含量超標是集約化高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖常遇到的問題[16]。淡水魚類鰓部能夠通過與氯離子競爭自外界環(huán)境中主動吸收亞硝酸根離子，水環(huán)境中亞硝態(tài)氮的累積會對淡水魚類造成潛在危害。亞硝態(tài)氮在魚體內(nèi)累積的主要毒害作用是將血紅蛋白中的亞鐵離子氧化成高鐵離子，從而抑制或降低血液供氧能力[17-18]。

本次試驗發(fā)現(xiàn)，在水溫25 ℃、pH 7.4、溶解氧6.3 mg/L的條件下，亞硝態(tài)氮對中華鳑鲏的24 h半致死質(zhì)量濃度(12.76 mg/L)要低于此前報道的高體鳑鲏(R.ocellatus)魚苗(97.05 mg/L)[19]、鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)(372.59 mg/L)[20]、鳙魚(Aristichthysnobilis)(411.20 mg/L)[20]、紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)(201.88 mg/L)[21]、暗紋東方鲀(T.obscurus)(202 mg/L)[22]、麥穗魚(Pseudorasboraparva)(422.862 mg/L)[23]。亞硝態(tài)氮對水生生物的毒性受多種內(nèi)外因素共同作用，其中最重要的影響因子有水質(zhì)(包括pH、溫度、陽離子、陰離子及溶解氧)、暴露時間、魚種及個體敏感性差異等[24-25]。試驗所采用的溫度和pH條件參考了已有的研究報道，pH、水溫和溶解氧也符合淡水魚類正常生長要求，排除了主要外在因素的干擾(氯離子和其他可能產(chǎn)生干擾的離子)，試驗結(jié)果具有一定的可比性。結(jié)果表明，中華鳑鲏對亞硝態(tài)氮比較敏感。

3.2 亞硝態(tài)氮對過氧化氫酶活性的作用

亞硝態(tài)氮通過血液擴散到紅細胞中發(fā)揮作用，血液是其在魚體中的主要靶位點[26-27]。已有報道表明亞硝態(tài)氮會誘發(fā)水生動物產(chǎn)生氧化應激[2,28]。因此本次試驗以血清為樣本，對其抗氧化酶活性進行分析。過氧化氫酶作為魚類抗氧化酶系統(tǒng)的一種關鍵酶類，在氧化應激時通過清除過氧化氫對機體起保護作用[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，在亞硝態(tài)氮脅迫下，過氧化氫酶活性在亞硝態(tài)氮各質(zhì)量濃度組均呈先升后降的趨勢，該結(jié)果與在日本蟳(Charybdisjaponica)和羅氏沼蝦(Macrbrachiumrosenbergii)中的觀察結(jié)果一致[30-31]。這可能是因為亞硝態(tài)氮短期脅迫會上調(diào)過氧化氫酶的表達量；但隨暴露時間的延長，機體產(chǎn)生的過量活性氧對脂類和蛋白造成氧化損傷，從而導致過氧化氫酶活性下降[31-33]。此外，統(tǒng)計分析結(jié)果表明，亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度對過氧化氫酶活性影響不顯著，這說明過氧化氫酶活性對亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度變化不敏感。

3.3 亞硝態(tài)氮對堿性磷酸酶活性的影響

Xu等[34]研究了日本沼蝦(M.nipponense)在急性和慢性亞硝態(tài)氮脅迫下的轉(zhuǎn)錄組變化，發(fā)現(xiàn)亞硝態(tài)氮對免疫相關的信號通路有不同程度的激活作用。堿性磷酸酶作為一類最重要的溶酶體酶，在免疫防御和細胞內(nèi)氧氣運輸方面均起著關鍵作用[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，在亞硝態(tài)氮脅迫下，各質(zhì)量濃度組堿性磷酸酶活性均呈先降后升再下降的趨勢，該結(jié)果與日本沼蝦的研究報道一致[36]。這可能因為堿性磷酸酶活性對亞硝態(tài)氮刺激反應比較敏感，短時間內(nèi)(24 h)機體免疫能力受到抑制；但隨著機體免疫信號通路的打開，產(chǎn)生生理性代償作用，酶活性在48 h出現(xiàn)短暫恢復；此后隨暴露時間延長，機體受到損傷、免疫代謝平衡被打破，導致酶活性再次出現(xiàn)下降[37-39]。

4 結(jié) 論

試驗結(jié)果表明，亞硝態(tài)氮對中華鳑鲏的急性毒性較強，因此在養(yǎng)殖過程中必須嚴格加以控制；亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度和暴露時間對堿性磷酸酶活性均有極顯著的影響，所以在套養(yǎng)模式中還可以考慮利用中華鳑鲏對環(huán)境中的亞硝態(tài)氮敏感性進行早期預警。