鄭軍榮，羅 婷，李志強，吳麗云

(福建省微生物研究所，福建省紅曲微生物技術(shù)開發(fā)應(yīng)用工程研究中心，福建 福州 350007 )

科技進(jìn)步使對蝦養(yǎng)殖業(yè)得到飛速發(fā)展，但高密度的大規(guī)模養(yǎng)殖引發(fā)了新的問題，如環(huán)境污染、水質(zhì)惡化使病害頻發(fā)從而導(dǎo)致對蝦產(chǎn)率低[1]。對由病毒[2]、細(xì)菌[3]或寄生蟲[4]等引起的病害最常用的手段是使用抗生素，而大量盲目使用抗生素在病害得到一定程度控制的同時養(yǎng)殖體系的微生態(tài)環(huán)境也遭到嚴(yán)重破壞，且抗生素殘留對人體健康的影響也日趨嚴(yán)重。因此，尋找綠色健康的養(yǎng)殖模式勢在必然。有研究報道，微生物在水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用[5-6]。因此，利用微生物來改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境，提高對蝦自身的免疫力已成為新的研究熱點[7-10]。

目前，微生態(tài)制劑已用于對蝦的養(yǎng)殖，但養(yǎng)殖過程中添加益生菌制劑的效果不如人意[11]。除了菌株是否真正具有所謂的抗弧菌、抗致病菌和病毒等功能以外，菌株能否在對蝦腸道內(nèi)定殖也是一個很關(guān)鍵的問題。由于不同品種的對蝦腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)和特性并不相同，能發(fā)揮效能的益生菌不僅與來自陸地的種類有差異，且不同對蝦腸道間的菌群種類也各不相同[12-14]。因此，自養(yǎng)殖的對蝦腸道直接分離篩選有益微生物用于對蝦的養(yǎng)殖則更具價值。凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)是我國最主要的養(yǎng)殖對蝦之一，筆者旨在通過利用乳酸菌培養(yǎng)基對凡納濱對蝦腸道中的益生菌進(jìn)行分離、分子生物學(xué)鑒定，并利用體外抗菌的方法篩選有抗菌活性的菌株，獲得1～2株抗性菌用于對蝦室內(nèi)養(yǎng)殖研究，為今后大規(guī)模推廣提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康凡納濱對蝦成蝦(6～7 cm)和仔蝦(1～2 cm)樣品采集于福建某凡納濱對蝦養(yǎng)殖基地；對蝦病原菌株副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)由集美大學(xué)實驗室提供；金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和沙門氏菌(Samonella)由本實驗室保存。Ezup柱式細(xì)菌和真菌基因組DNA抽提試劑盒購于生工生物工程(上海)股份有限公司；PCR及測序引物(ITS基因正向ITS5和反向引物ITS4；16S rDNA基因正向引物27F和反向引物1492R)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；糞便基因組DNA提取試劑盒購于天津天根公司；乳酸菌培養(yǎng)基購于青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集和蝦腸道的預(yù)處理

將仔蝦和成蝦分別裝在無菌的三角瓶中取回。取饑餓1 d后腸道無明顯糞便的對蝦，用無菌水沖洗后，以75%的酒精浸泡10 min，再用無菌水沖洗，隨后用無菌牙簽將整個腸道取出，放入研磨器中研磨，制成勻漿液。

1.2.2 蝦腸道中的微生物分離及純化

均質(zhì)樣品進(jìn)行梯度稀釋，取0.1 mL的各稀釋液，涂布到乳酸菌培養(yǎng)基平板上，30 ℃厭氧培養(yǎng)約48 h，挑取不同形態(tài)的單菌落進(jìn)行純化。

1.2.3 分離菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

純化單菌落分別接種到乳酸菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)與生長狀態(tài)。挑取菌落用革蘭氏染色，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，并根據(jù)菌株的菌落形態(tài)和顯微鏡下特征進(jìn)行初步分類。

1.2.4 分離菌株的分子生物鑒定

細(xì)菌用細(xì)菌DNA試劑盒提取DNA后，PCR擴增16S rDNA序列(引物27F為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R為5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)；酵母用真菌DNA提取試劑盒提取DNA后，擴增ITS序列(引物ITS5為5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，ITS4為5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)；采用文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行擴增。擴增的DNA片段進(jìn)行序列測定(委托上海生工完成)。將獲得的菌株ITS序列在美國國立生物技術(shù)信息中心的GenBank進(jìn)行比對,16S rDNA序列在Ezbiocloud中比對，初步確定同源性很高的種屬，隨后將所得序列與初步確定種的模式菌株序列運用Mega 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，進(jìn)一步確定最接近的種屬。

1.2.5 分離菌株的抗菌活性

分離菌株、病原菌分別用肉湯液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，菌株生長良好。取病原菌0.1 mL涂布于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上，隨后將滴加了10 μL分離菌菌液的無菌小圓形濾紙貼于其上，培養(yǎng)約48 h觀察抑菌情況。

1.2.6 部分菌株復(fù)合飼料對對蝦生長的影響

選擇抑菌效果好的2株菌用液體培養(yǎng)基進(jìn)行振蕩富集培養(yǎng)24 h，離心獲取菌體進(jìn)行冷凍干燥，取凍干菌渣與飼料混合或包埋制成108cfu/g的2種不同的益生菌復(fù)合制劑。模擬室外條件，塑料收納箱中水體溫度28 ℃、鹽度20、pH 7.0～8.0、溶解氧7.0～8.0 mg/L、對蝦養(yǎng)殖密度200 尾/m2，同時用添加2種不同的益生菌復(fù)合制劑飼料以不同方式喂養(yǎng)仔蝦，以直接投喂飼料為對照組，每組2個平行。早晚各投喂1次，投喂量約為蝦體質(zhì)量的10%，定期補水，2個月后觀察對蝦的成活情況。

1.2.7 益生菌飼養(yǎng)對蝦對弧菌的抵抗力以及腸道菌群的影響

將不同方式喂養(yǎng)的對蝦分成兩部分，對其中一部分對蝦用終密度105cfu/mL副溶血弧菌侵染，觀察侵染7 d后對蝦的存活情況。隨后用糞便基因組DNA提取試劑盒提取侵染和未侵染弧菌的對蝦腸道DNA，對腸道菌群16S rDNA區(qū)段高通量測序(杭州晶佰生物科技公司)，比較菌群差異。

2 結(jié) 果

2.1 菌株的分離與篩選

通過用乳酸菌培養(yǎng)基對凡納濱對蝦腸道微生物進(jìn)行分離篩選，共獲得7株菌，其中4株芽孢桿菌、1株酵母菌和2株腸球菌。經(jīng)過初步的抗性試驗，最終選定1株酵母菌和3株芽孢桿菌(W7、W25、W27、W31)作為進(jìn)一步的研究對象。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

菌株W7、W25、W27、W31在乳酸菌培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)見圖1。菌株W7菌落為圓形，淺黃色，隆起，光滑，濕潤，G+，細(xì)胞為卵圓形或橢圓形，出芽生殖，可以初步確定菌株W7是啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。菌株W25菌落極小為圓形，淺黃色，微凸，表面濕潤，G+，細(xì)胞為短小桿狀，部分有芽孢。菌株W27菌落圓形，淺黃色，扁平，表面粗糙，邊緣不規(guī)則，G+，細(xì)胞為桿狀，部分有芽孢。菌株W31菌落為圓形，灰白色，邊緣不規(guī)則，表面皺褶，中間微凸，干燥，G+，細(xì)胞為桿狀，有芽孢。由菌落形態(tài)和顯微形態(tài)確定菌株W25、W27和W31是芽孢桿菌(Bacillus)。

2.2.2 分離菌株的分子生物鑒定

對菌株W7擴增ITS序列片段約為800 bp，測序后美國國立生物技術(shù)信息中心中Blast分析，結(jié)果只有與啤酒酵母有很高的同源性(96%)，結(jié)合形態(tài)學(xué)進(jìn)一步確定其為啤酒酵母菌。

對3株芽孢桿菌擴增16S rDNA序列，大小約1500 bp、經(jīng)測序后在Ezbiocloud中分析，結(jié)果每株都有幾個與其同源性在99%以上的種(表1)。利用3株菌及相似種的模式菌株的16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育圖分析發(fā)現(xiàn)，菌株W25與短小芽孢桿菌 (B.pumilus) ATCC7061(ABRX01000007)的進(jìn)化距離最近，同源性為99.93%；菌株W27與枯草芽孢桿菌沙漠亞種(B.subtilisssp.inaquosorum) KCTC13429(AMXN01 000021)的進(jìn)化距離最近，同源性為99.93%；菌株W31與暹羅芽孢桿菌(B.siamensis) KCTC 13613(AJVF01000043)的進(jìn)化距離最近，同源性為99.93%(圖2)。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)可以初步確定菌株W25與短小芽孢桿菌ATCC7061為同一種；菌株W27與枯草芽孢桿菌亞種KCTC13429為同一種；菌株W31與暹羅芽孢桿菌KCTC13613為同一種。

圖1 4株菌在乳酸菌培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和顯微鏡下形態(tài)(革蘭氏染色)

菌株編號相似菌株登錄號相似性/%錯配/總數(shù)W25短小芽孢桿菌ATCC7061ABRX0100000799.931/1404南海芽孢桿菌 (B. australimaris) NH7I_1JX68009899.862/1404沙福芽孢桿菌(B. safensis)FO-36bASJD0100002799.862/1404高地芽孢桿菌(B. altitudinis)41KF2bASJC0100002999.576/1404廈門芽胞桿菌(B. xiamenensis )HYC-10AMSH0100011499.507/1404萎縮芽孢桿菌(B. atrophaeus)JCM9070AB02118197.2938/1404暹羅芽孢桿菌KCTC13613AJVF0100004397.0841/1404W27特基拉斯芽孢桿菌(B. tequilensis)KCTC13622AYTO0100004399.931/1404枯草芽孢桿菌沙漠亞種KCTC13429AMXN0100002199.931/1404枯草芽孢桿菌枯草亞種(B. subtilis ssp. subtilis)NCIB3610ABQL0100000199.862/1404薄壁芽孢桿菌(B. halotolerans)ATCC25096LPVF0100000399.793/1404枯草芽孢桿菌亞種(B. subtilis ssp. spizizenii)NRRLB-23049CP00290599.793/1404

續(xù)表1

菌株編號相似菌株登錄號相似性/%錯配/總數(shù)W27中田芽孢桿菌(B. nakamurai)NRRLB-41091LSAZ0100002899.724/1404莫海威芽孢桿菌(B. mojavensis)RO-H-1JH60028099.724/1404死谷芽孢桿菌(B. vallismortis)DV1-F-3JH60027399.576/1404暹羅芽孢桿菌KCTC13613AJVF0100004399.576/1404萎縮芽孢桿菌JCM9070AB02118199.349/1404W31暹羅芽孢桿菌KCTC13613AJVF0100004399.931/1358枯草芽孢桿菌枯草亞種NCIB3610ABQL0100000199.783/1358解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)DSM7FN59764499.714/1358中田芽孢桿菌NRRLB-41091LSAZ0100002899.635/1358特基拉斯芽孢桿菌KCTC13622AYTO0100004399.566/1358枯草芽孢桿菌沙漠亞種KCTC13429AMXN0100002199.566/1358死谷芽孢桿菌DV1-F-3JH60027399.487/1358薄壁芽孢桿菌ATCC25096LPVF0100000399.418/1358枯草芽孢桿菌亞種NRRLB-23049CP00290599.418/1358萎縮芽孢桿菌JCM9070AB02118199.418/1358

圖2 菌株W25、W27、W31的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 分離菌株的抗菌特性

對4株菌株進(jìn)行體外抗副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的試驗。試驗結(jié)果可知，啤酒酵母W7對副溶血弧菌和沙門氏菌有抑菌效果，但是抑菌圈不透明，仍有部分細(xì)菌生長，抑菌作用不明顯，而對金黃色葡萄球菌的抑菌圈明顯透明，抑制作用明顯。短小芽孢桿菌W25和枯草芽孢桿菌沙漠亞種W27對副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用，但對沙門氏菌抑菌效果不明顯，暹羅芽孢桿菌W31對3株病原菌均有明顯抑制作用，且暹羅芽孢桿菌W31的抑菌透明圈最大，效果最好(表2)。

表2 分離菌株對不同病原菌的抑制效果

2.4 部分菌株復(fù)合飼料對對蝦生長的影響

選擇啤酒酵母W7和暹羅芽孢桿菌W31發(fā)酵的菌體凍干后與飼料做成兩種益生菌劑，以普通飼料(對照)、混合益生菌劑、包埋益生菌劑及混合益生菌劑+普通飼料同時飼養(yǎng)這幾種不同的方式喂養(yǎng)幼蝦。2個月后發(fā)現(xiàn)益生菌飼養(yǎng)的對蝦組的成活率均相對高于普通飼料投喂的對照組(表3)。

表3 啤酒酵母W7和暹羅芽孢桿菌W31益生菌飼料對對蝦成活率的影響

2.5 益生菌飼養(yǎng)對蝦對弧菌的抵抗力以及腸道菌群的影響

對試驗組1、2、3、4中每組2個平行中的1個平行進(jìn)行副溶血弧菌侵染，依次編號為5、6、7、8。7 d后，投喂普通飼料的對照組(試驗組5)的死亡率最高，明顯高于投喂益生菌的試驗組(表4)。

表4 益生菌飼養(yǎng)對蝦對弧菌的抵抗力

對未侵染副溶血弧菌的各試驗組(1～4)及侵染副溶血弧菌的各試驗組(5～8)的對蝦腸道微生物進(jìn)行16S rDNA測序分析，結(jié)果見圖3。由圖3可知，未侵染試驗組中無弧菌，而所有侵染試驗組中均有弧菌。對未侵染試驗組的菌群分析發(fā)現(xiàn)，與未添加益生菌的試驗組1相比，添加益生菌的試驗組2～4中芽孢桿菌的豐度并未明顯增加，但是氣單胞菌屬(Aeromonas)和變形桿菌屬(Proteus)豐度變小了，γ-變形桿菌綱和希瓦氏菌屬(Shewanella)豐度增加了，而且含有試驗組1中未出現(xiàn)的菌群，說明益生菌的添加確實能夠明顯地影響對蝦腸道菌群的結(jié)構(gòu)。侵染試驗組5～8的菌群分析結(jié)果顯示，不同方式飼養(yǎng)的對蝦腸道的弧菌豐度有明顯的差異，其中普通飼料試驗組5中弧菌含量最高，混合益生菌試驗組6中弧菌最少，這說明益生菌在一定程度上抑制了弧菌的生長。

圖3 多個對蝦腸道樣品菌群分布1～8對應(yīng)表3和表4中相應(yīng)試驗組的腸道樣品菌群.

3 討 論

有研究報道,對蝦腸道微生物的組成和數(shù)量與其發(fā)育時期、養(yǎng)殖模式和生存環(huán)境變化有很大的相關(guān)性[16]。本試驗前期對不同階段凡納濱對蝦腸道及其水體中可培養(yǎng)的微生物進(jìn)行了比較研究，確定其腸道和水體中的微生物有一定的相關(guān)性。盡管不同時期對蝦腸道中的微生物有一定的差異，但均有腸球菌、酵母菌和各種芽孢桿菌，這些菌類可能是對蝦腸道中的優(yōu)勢菌。

利用特定的培養(yǎng)方式能夠自大量的微生物中快速分離目的菌株，分子生物學(xué)方法能在短時間內(nèi)對大量菌株快速鑒定到屬種，是目前一種快速短時獲得目的菌株的有效手段[17-18]。乳酸菌是對蝦腸道內(nèi)重要的微生物菌群，對其健康至關(guān)重要。乳酸菌培養(yǎng)基是分離腸道中各種乳桿菌、乳球菌的主要培養(yǎng)基，本試驗利用乳酸菌培養(yǎng)基自對蝦腸道中不僅快速分離到幾種不同的腸球菌，還分離到酵母菌和芽孢桿菌。雖然起初目的是大量分離各種乳桿菌，結(jié)果卻分離到腸球菌。對從腸道上分離到芽孢桿菌和酵母菌實屬意外，說明對蝦腸道內(nèi)存在著一定數(shù)量的酵母菌和芽孢桿菌，這些菌株也適合在乳酸菌培養(yǎng)基上生長。其中W7、W25、W27和W31 這4株不同形態(tài)的菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定初步確定為1株啤酒酵母，3株芽孢桿菌。利用ITS和16S rDNA測序?qū)@4株菌進(jìn)行快速鑒定，確定菌株W7為啤酒酵母，菌株W25為短小芽孢桿菌，菌株W27為枯草芽孢桿菌沙漠亞種，菌株W31為暹羅芽孢桿菌。這些菌株并非新種，但不同來源的同種菌株也具有株間功能性差異，因此有一定的研究價值。分子生物學(xué)鑒定分析有優(yōu)勢也有缺陷，本試驗確定的4株菌與已知菌株的同源性研究還需進(jìn)一步試驗。

此外，菌株在應(yīng)用之前確定是否具有某種功能，采用抗性篩選是獲得有益菌目的菌株的手段之一，并已取得了良好的效果[19-21]。利用病原菌副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌對獲得的4株菌的體外抑菌功能進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，啤酒酵母W7對金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用，但對其他2株菌的抑制作用不明顯；短小芽孢桿菌W25和枯草芽孢桿菌沙漠亞種W27對副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抑制作用，但對沙門氏菌作用不明顯；暹羅芽孢桿菌W31對3株病原菌均有抑制作用，且抑菌效果最好。進(jìn)一步說明這些菌株產(chǎn)生的某種物質(zhì)可能對致病菌的繁殖有不同程度的抑制作用，因此，添加益生菌可以調(diào)控對蝦養(yǎng)殖環(huán)境中致病菌的生長，從而改善養(yǎng)殖條件。

有研究報道，益生菌復(fù)合使用具有協(xié)同作用，比單菌的效果更好[18]。已有的研究表明，對蝦養(yǎng)殖中添加外源益生菌，對養(yǎng)殖水體和腸道菌群有明顯影響，能夠一定程度上提高對蝦的生長速率、免疫力、抗病力或抗氨氮能力[22-24]。本試驗利用啤酒酵母W7和暹羅芽孢桿菌W31的菌體與基礎(chǔ)飼料混合喂養(yǎng)對蝦，能夠明顯地提高對蝦的成活率以及對弧菌的抵抗力。對蝦的腸道菌群分析發(fā)現(xiàn)，益生菌的添加未必能明顯地提高相應(yīng)菌的含量，但可以改變腸道菌群中氣單胞菌屬、變形桿菌屬和希瓦氏菌屬等的豐度以及菌群結(jié)構(gòu)的組成。氣單胞菌為條件致病菌，其豐度減少可在一定程度上降低對蝦的死亡率。此外，菌群結(jié)構(gòu)的變化也可能會改變對蝦自身的免疫力及對不利環(huán)境的抵抗能力，從而提高成活率。進(jìn)一步的試驗也發(fā)現(xiàn)，益生菌的添加在一定程度上抑制了弧菌的繁殖，減少了弧菌的豐度，進(jìn)而降低了對蝦體的攻擊力度，從而降低對蝦的死亡率。據(jù)此可以確定，益生菌制劑能夠改變對蝦腸道的菌群，也可在一定程度上抑制弧菌的繁殖，但兩者之間是否有必然聯(lián)系則需進(jìn)一步的研究。試驗也說明，利用來自對蝦腸道的菌株制成對蝦益生菌飼料確實可行，為進(jìn)一步開發(fā)對蝦微生態(tài)制劑奠定了基礎(chǔ)。但是這些菌株在投喂中的具體作用機理、是否適用于大規(guī)模室外投喂以及投喂方式和最佳劑量等問題有待于進(jìn)一步的研究。