張梅，石秀英，李林娟，薛亞妮

隨著社會(huì)的進(jìn)步，人們的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大的改變，日常攝入的高脂高熱量食物增多，使得非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)的發(fā)病率顯著升高[1]。NAFLD的主要特征為肝細(xì)胞脂肪變性和脂肪蓄積，同時(shí)患者無(wú)過(guò)量飲酒史[2]。NAFLD 疾病譜包括單純性非酒精性脂肪肝，嚴(yán)重患者會(huì)發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎或肝纖維化以及肝硬化，甚至發(fā)展為肝細(xì)胞癌[3]。胰島素JNK1信號(hào)通路是激活炎性反應(yīng)的主要影響因素之一。Smith等[4]研究表明：JNK1基因敲除可以減輕炎癥及高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和肝脂肪變，達(dá)到防止肝臟炎性反應(yīng)和肝纖維化的效果。利拉魯肽(liraglutide)是長(zhǎng)效人胰高血糖素樣肽-1 (glucagon like peptide-1，GLP-1)的類似物，與GLP-1具有同源性，由食物刺激小腸 L 細(xì)胞分泌[5-6]。相比其類似物GLP-1，利拉魯肽有效半衰期延長(zhǎng)，作用持久，不經(jīng)過(guò)肝臟、腎臟降解排泄，使得利拉魯肽備受關(guān)注。楊穎博等[7]研究表明：當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)高血糖時(shí)，利拉魯肽能刺激胰島素分泌，同時(shí)能夠抑制胰高血糖素分泌；在機(jī)體出現(xiàn)低血糖時(shí)，利拉魯肽能夠減少胰島素分泌。同時(shí)利拉魯肽可以通過(guò)抑制食欲、延緩胃排空、增加飽腹感等多種機(jī)制抑制脂肪在肝臟堆積。本文旨在研究利拉魯肽對(duì)NAFLD大鼠肝臟組織中胰島素JNK1信號(hào)通路的影響，以期了解利拉魯肽對(duì)NAFLD大鼠肝臟組織中胰島素JNK1信號(hào)通路的作用機(jī)理，從而為NAFLD的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

選取40只6周齡SPF級(jí)大鼠，體質(zhì)量170～230 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2017-0022，普通級(jí)，分8個(gè)籠子飼養(yǎng)，每個(gè)籠子5只。飼養(yǎng)于醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室。

1.2 藥物與試劑

利拉魯肽(商品名：諾和力；批號(hào)：DP51077)購(gòu)自丹麥諾和諾德公司；胰島素受體抗體(貨號(hào)：ab5500)購(gòu)自Abcam公司；C-Jun氨基端激酶1抗體 (貨號(hào)：CST3708)購(gòu)自CST公司；磷酸化胰島素受體底物1抗體(貨號(hào)：CST9215)購(gòu)自CST公司；磷酸化C-Jun氨基端激酶1抗體 (貨號(hào)：CST2381)購(gòu)自CST公司；β-actin抗體購(gòu)自武漢華聯(lián)科有限公司。

1.3 儀器

低溫離心機(jī)購(gòu)自湖南恒諾離心機(jī)有限公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；721分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)sigma公司；恒溫水箱購(gòu)自上海信帆生物科技有限公司；切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司；低溫離心機(jī)購(gòu)自湖南恒諾離心機(jī)有限公司；ADVIA 2400 全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自德國(guó)西門子公司；電子天平購(gòu)自上海精天天平廠產(chǎn)品。

2 方法

2.1 建立模型

選取30只大鼠隨機(jī)分為模型組、低劑量利拉魯肽組和高劑量利拉魯肽組，給予高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料配方見表1；另設(shè)10只大鼠為對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)。持續(xù)18 d后，高脂飼料喂養(yǎng)的每組處死2只大鼠，根據(jù)朱曉寧等[7]研究得出的方法判斷建立NAFLD大鼠模型是否成功。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

表1 大鼠飼料成分表

2.2 分組及藥物干預(yù)

根據(jù)建立模型時(shí)的處理方法上述大鼠被分為：對(duì)照組(control)、模型組(model)、低劑量利拉魯肽組(low lira)和高劑量利拉魯肽組(high lira)，其中模型組、低劑量利拉魯肽組和高劑量利拉魯肽組每組8只，對(duì)照組10只。低劑量利拉魯肽組使用0.6 mg/(kg·d)劑量的利拉魯肽腹腔注射，每日一次，次持續(xù)18 d；高劑量利拉魯肽組使用1.2 mg/(kg·d)劑量的利拉魯肽腹腔注射，每日一次，次持續(xù)18 d。

2.3 檢測(cè)項(xiàng)目

2.3 1 一般情況的觀察

準(zhǔn)確稱量大鼠體質(zhì)量，處死大鼠后取其肝臟病監(jiān)測(cè)器肝臟濕重并計(jì)算肝指數(shù)。肝指數(shù)=肝臟濕重/體質(zhì)量×100%。

2.3.2 測(cè)定大鼠血清ALT、FBG、TG、TC和FINS變化

嚴(yán)格按照全自動(dòng)生化檢測(cè)儀使用方法檢測(cè)大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)和血清胰島素(FINS)變化。

2.3.3 酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定大鼠肝組織中TNF-α、SOD、MAD和FFAs含量

嚴(yán)格按照按照酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒測(cè)操作，測(cè)定大鼠肝組織中腫瘤壞死因子(TNF-α)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MAD)及游離脂肪酸(FFAs)含量。

2.3.4 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

按照Western blot 檢測(cè)方法操作，使用蛋白質(zhì)條帶用掃描儀進(jìn)行掃描，以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用Imagaquent 5.1軟件對(duì)胰島素受體(IR)、磷酸化胰島素受體底物1(p-IRS1,Ser307位點(diǎn))、C-Jun氨基端激酶1(JNK1)及磷酸化C-Jun氨基端激酶1(p-JNK1)蛋白質(zhì)條帶灰度進(jìn)行相對(duì)定量分析。以目的蛋白條帶與 β-actin 灰度比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值為最終結(jié)果。

2.3.5 染色觀察大鼠肝臟組織變化

將大鼠處死后取大鼠肝臟組織經(jīng)過(guò)固定、沖洗、脫水、浸蠟、包埋、切片、貼片、烤片、脫蠟、染色、封片、烘干等步驟處理后，使用蘇木精-伊紅染色，毎張切片光鏡下觀察 5 個(gè)視野，在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肝臟組織病理學(xué)變化。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠體質(zhì)量及肝指數(shù)變化

由表2可以看出，相比對(duì)照組，模型組大鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)顯著增加，且兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；相比模型組，利拉魯肽組大鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)顯著降低，且高劑量利拉魯肽組顯著低于低劑量利拉魯肽組；兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表2 大鼠體質(zhì)量及肝指數(shù)變化檢測(cè)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

3.2 大鼠血清ALT、FBG、TG、TC和FINS含量檢測(cè)

由表3可以看出，相比對(duì)照組，模型組大鼠血清ALT、TG、TC和FINS含量顯著增加，且兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，F(xiàn)BG含量無(wú)顯著變化(P>0.05)；相比模型組，利拉魯肽組大鼠血清ALT、TG、TC和FINS含量顯著降低，且高劑量利拉魯肽組顯著低于低劑量利拉魯肽組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，F(xiàn)BG含量則無(wú)顯著變化(P>0.05)。

表3 大鼠血清ALT、FBG、TG、TC和FINS檢測(cè)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

3.3 酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定大鼠肝組織中TNF-α、SOD、MAD和FFAs含量

由圖1可以看出，相比對(duì)照組，模型組大鼠SOD含量顯著降低、TNF-α、MAD和FFAs含量顯著升高，且兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；相比模型組，利拉魯肽組大鼠SOD含量顯著升高，且高劑量利拉魯肽組顯著高于低劑量利拉魯肽組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；相比模型組，利拉魯肽組大鼠TNF-α、MAD和FFAs含量顯著降低，且高劑量利拉魯肽組顯著低于低劑量利拉魯肽組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3.4 大鼠肝臟組織中IR、p-IRS1、JNK1及p-JNK表達(dá)檢測(cè)

由圖2可以看出，相比對(duì)照組，模型組大鼠p-IRS1、JNK1及p-JNK蛋白表達(dá)顯著升高，且兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，IR表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)；相比模型組，利拉魯肽組大鼠p-IRS1、JNK1及p-JNK蛋白表達(dá)顯著降低，且高劑量利拉魯肽組顯著低于低劑量利拉魯肽組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，IR表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)。

3.5 HE染色觀察大鼠肝臟組織病理學(xué)變化

由圖3可以看出，對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整且清晰，肝臟中央靜脈大且壁薄，肝細(xì)胞呈放射狀分布，且肝細(xì)胞呈多邊形，大小一致且排列整齊，肝竇和核結(jié)構(gòu)清晰可見。模型組大鼠組肝細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)重度彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變，在肝細(xì)胞內(nèi)部部分小葉內(nèi)有壞死灶，且以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞出現(xiàn)浸潤(rùn)，部分出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死和灶狀壞死。低劑量利拉魯肽組和高劑量利拉魯肽組肝細(xì)胞明顯較高脂組肝細(xì)胞體積縮小，未見脂肪變性，肝小葉內(nèi)未見炎癥。

圖1大鼠肝組織TNF-α、SOD、MAD和FFAs含量測(cè)定 與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

圖2大鼠肝組織中IR、p-IRS1、JNK1及p-JNK表達(dá)檢測(cè) 與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；A為對(duì)照組；B為模型組；C為低劑量利拉魯肽組；D為高劑量利拉魯肽組

4 討論

IR與NAFLD的發(fā)病有著密切的關(guān)系， JNK1蛋白在在肥胖引起的IR中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[9]。邱涵等[10]研究證明：胰島素信號(hào)傳導(dǎo)時(shí)，胰島素會(huì)和細(xì)胞表面胰島素受體結(jié)合，使得胰島素受體活化導(dǎo)致JNK1信號(hào)通路中的受體蛋白磷酸化。胰島素受體底物主要有多種異構(gòu)體，最重要的是IRS-1，這種異構(gòu)體可以其介導(dǎo)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)生障礙并且使得使胰島素作用的外周靶組織均發(fā)生IR。Nishina等[11]研究表明，JNKI活化介導(dǎo)了IRS1-中的Ser3O7磷酸化并且使得IRS-1對(duì)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)作用，并且增加了胰島素的敏感性。本實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)，在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型中胰島素敏感組織脂肪等JNK活性明顯升高，使用利拉魯肽作用后大鼠JNK 1及p-IRS1顯著降低，說(shuō)明利拉魯肽可以有效地抑制JNK信號(hào)通路，且抑制NAFLD的發(fā)生，這和石志平等[12]研究結(jié)論相一致。

圖3大鼠肝臟組織病理學(xué)變化(HE，×400) A為對(duì)照組；B為模型組；C為低劑量利拉魯肽組；D為高劑量利拉魯肽組

目前診斷NAFLD的方法較多[13]，其中血清 ALT 水平是無(wú)創(chuàng)性診斷方法中重要的一種生化指標(biāo)?；羟偾俚萚14]研究表明，利拉魯肽可以減輕高脂誘導(dǎo)的肝脂肪變同時(shí)降低肝組織炎癥指標(biāo)水平達(dá)到治療NAFLD的作用。劉麗波等[15]臨床研究證明，NAFLD患者使用 GLP-1類似物干預(yù) 12 周后，血清 ALT 水平明顯下降。本實(shí)驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠血清ALT含量顯著升高，使用利拉魯肽處理后，ALT含量顯著降低，說(shuō)明利拉魯肽可以有效降低肝臟組織中的炎癥，達(dá)到緩解和治療NAFLD的作用。帖彥清等[16]研究表明，NAFLD患者中，由于肝內(nèi)大量脂質(zhì)沉積，使得過(guò)氧化產(chǎn)物如丙二醛(MAD)含量增加，并且會(huì)使得患者機(jī)體的抗氧化能力減弱，導(dǎo)致肝細(xì)胞膜和線粒體膜受損，引起血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶升高，同時(shí)也會(huì)使得大鼠的肝組織游離脂肪酸(FFAs)水平明顯升高，誘發(fā)肝細(xì)胞死亡導(dǎo)致肝臟炎癥反應(yīng)和細(xì)胞功能障礙[17]。MAD的含量可以反映機(jī)體內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，使自由基與生物膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)并使得氧化產(chǎn)物分解，由此可以得知MAD的含量可間接反映出細(xì)胞損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)中可以看出，模型組大鼠體內(nèi)MAD及FFAs含量顯著升高，使用利拉魯肽處理后MAD及FFAs含量顯著降低，說(shuō)明利拉魯肽可以有效降低大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，且可以有效降低脂質(zhì)氧化產(chǎn)物并降低肝臟細(xì)胞的炎癥，達(dá)到緩解NAFLD的作用，與龐曉寧等[18]的結(jié)論一致。

綜上所述，利拉魯肽可以有效的抑制NAFLD大鼠肝臟組織中胰島素JNK1信號(hào)通路并對(duì)肝功能起到保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與降低JNK1的表達(dá)以及抑制JNK1的磷酸化有關(guān)。但因NAFLD涉及到的信號(hào)通路及蛋白較多，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中可以進(jìn)一步探討利拉魯肽通過(guò)其他信號(hào)通路及蛋白的表達(dá)對(duì)NAFLD的治療效果及作用機(jī)理。