譚瓛,劉云杰

胃癌是臨床常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，我國(guó)胃癌的發(fā)病率及病死率均居世界前列，在各類惡性腫瘤的死因中位列第二，嚴(yán)重影響國(guó)人的生命健康[1]。近年來(lái)，隨著醫(yī)療技術(shù)及醫(yī)療手段的不斷發(fā)展，臨床采用內(nèi)鏡下摘除及外科手術(shù)等綜合治療措施治療早期胃癌已取得很好的療效，早期胃癌患者治療后5年生存率可高達(dá)90%以上[2]。但是，胃癌早期不易發(fā)現(xiàn)，患者在確診時(shí)大多已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或浸潤(rùn)，錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)，手術(shù)治療已很難根治，療效不佳[3]。因此，如果能從分子學(xué)角度，分析胃癌的發(fā)生機(jī)制，將有助于胃癌的早期診斷及治療，改善預(yù)后[4]。微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一類非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度約為19～23個(gè)核苷酸，廣泛存在于真核生物中[5]。miRNAs可調(diào)控人體超過(guò)30%的基因，與生物體內(nèi)各項(xiàng)生物學(xué)性能密切相關(guān)，參與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、遷移、侵襲及周期調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程[6]。大量研究顯示，多種腫瘤細(xì)胞中可檢測(cè)到miRNAs的異常表達(dá)，其能發(fā)揮抑制或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生及發(fā)展的作用[7]。miR-33a為位于Srebp基因的內(nèi)含子上的一個(gè)高度保守的miRNA，被證實(shí)在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，近年來(lái)其與腫瘤之間的關(guān)系逐漸受到研究人員的關(guān)注與重視[8]。本研究采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析miR-33a在胃癌組織中的表達(dá)，并通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究miR-33a對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，旨在為臨床診斷及治療胃癌提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 胃癌組織標(biāo)本及胃癌細(xì)胞

收集2016年3月至2017年12月在我院外科住院患者的胃癌標(biāo)本40例，標(biāo)本來(lái)源患者中女18例，男22例；年齡35～78歲，平均(52.33±6.89)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理檢測(cè)證實(shí)為胃癌，術(shù)前未接受任何放療及化療，臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前接受化療或放療，臨床病理資料不完整。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施，所有患者均知情并簽署知情同意書。每例標(biāo)本分別取癌組織及癌旁正常組織放入凍存管，置于液氮罐中保存?zhèn)溆谩Ｈ宋赴┘?xì)胞株SGC-7907購(gòu)于上海生科院細(xì)胞研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

細(xì)胞培養(yǎng)基(美國(guó)Science公司)，胰酶(美國(guó)Life Technology公司)，Trizol與轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體(美國(guó)invitrogen公司)，胎牛血清(美國(guó)Life Technology公司)；miR-33a引物及miR-33a模擬物(上海生工生物有限公司)；顯微鏡(日本Olympus公司)；PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)PE公司)；恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將人胃癌細(xì)胞株SGC-7907分散于含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(35 ℃，5%CO2)培養(yǎng)。參照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書，以脂質(zhì)體為載體將miR-NC(陰性對(duì)照)和miR-33a模擬物(miR-33a mimics)分別轉(zhuǎn)染至SGC-7907細(xì)胞，隨后將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)

分別取200 mg胃癌組織及癌旁正常組織，于研缽中研碎后采用Trizol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，選擇待檢測(cè)基因的合適上下游引物，以cDNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增待檢測(cè)基因，基因產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)。引物設(shè)計(jì)：miR-33a上游：5′-GGTGCATTGTAGTTGCATTGC-3′，下游：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′。以GAPDH為內(nèi)參蛋白。采用2-ΔΔCt法計(jì)算CDKN2B-AS1及miR-411-3p的相對(duì)表達(dá)量，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

分別取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SGC-7907細(xì)胞、轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-33a minmics的SGC-7907細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后分散于細(xì)胞培養(yǎng)基中制成單細(xì)胞懸浮液，以1×104個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種于96孔板，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(35 ℃，5%CO2)中孵育。分別于孵育后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h按照CCK-8檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書加入CCK-8試劑，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(OD450)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.4 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，胰酶消化，于不含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)24 h，經(jīng)胰酶消化后分散于不含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中制成單細(xì)胞懸浮液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，取300 μL加入Transwell小室的上室，下室加入500 μL含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后取出小室，除去上室內(nèi)液體，用棉簽擦凈膜上未遷移的細(xì)胞，采用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，于100倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)浸潤(rùn)至膜背面的細(xì)胞數(shù)，取平均值為各組細(xì)胞遷移數(shù)。

1.3.5 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲

將人工合成的基底膜材料Matrigel膠用7倍體積的無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋，取60 μL加于小室的各孔中，搖晃均勻后靜置過(guò)夜。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，胰酶消化，于不含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)24 h，經(jīng)胰酶消化后分散于不含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中制成單細(xì)胞懸浮液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，取300 μL加入Transwell小室的上室，下室加入500 μL含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后取出小室，用棉簽擦凈Matrigel膠后采用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，于100倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)浸潤(rùn)至膜背面的細(xì)胞數(shù)，取平均值為各組細(xì)胞侵襲數(shù)。

1.3.6 細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)

向24孔板中加入Matrigel原膠溶液，0.2 mL/孔，風(fēng)干過(guò)夜(37 ℃)，PBS清洗兩次，每孔加入0.2 mL 3%牛血清蛋白，孵育2 h，PBS清洗兩遍。將各組細(xì)胞按1×103個(gè)/孔的密度接種于上述預(yù)處理的24孔板，于37 ℃保溫20、40、60、后，輕輕拭去未粘著的細(xì)胞，PBS清洗兩遍，于100倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)粘附細(xì)胞數(shù)，取平均值為各組粘附細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-33a在胃癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)

40例患者胃癌組織中miR-33a相對(duì)表達(dá)量為0.73±0.15，低于癌旁正常組織的1.29±0.26，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.799,P<0.001)，見(jiàn)圖1。

2.2 miR-33a對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響

隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，Control、miR-NC及miR-33a mimics組細(xì)胞OD450逐漸升高(P均<0.01)。培養(yǎng)12 h及24 h時(shí)，各組細(xì)胞OD450無(wú)明顯差異(P>0.05)。培養(yǎng)36 h、48 h及60 h后，Control組與miR-CN組細(xì)胞OD450無(wú)明顯差異(P>0.05)，均高于miR-33a mimics組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

圖1胃癌組織及癌旁正常組織中miR-33a相對(duì)表達(dá)量比較與癌旁正常組織比較，aP<0.001

2.3 miR-33a對(duì)胃癌細(xì)胞遷移的影響

miR-33a mimics組遷移細(xì)胞數(shù)為(32.65±3.48)個(gè)，低于Control組(62.33±5.23)個(gè)的及miR-NC組的(59.65±4.78)個(gè)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.4 miR-33a對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲的影響

miR-33a mimics組侵襲細(xì)胞數(shù)為(22.13±2.03)個(gè)，低于Control組的(54.36±4.12)個(gè)(P<0.01)及miR-NC組的(52.25±3.98)個(gè)(P<0.01)，見(jiàn)表2。

2.5 miR-33a對(duì)胃癌細(xì)胞粘附的影響

表1 孵育不同時(shí)間后三組細(xì)胞OD450比較

注：與Control組比較，*P<0.05；與miR-NC組比較，#P<0.05

圖2miR-33a對(duì)胃癌細(xì)胞遷移的影響(×200) (a)Control組；(b)miR-NC組；(c)miR-33a mimics組

表2 不同組細(xì)胞侵襲數(shù)比較個(gè))

注：與Control組比較，*P<0.01；與miR-NC組比較，#P<0.01

隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)，miR-33a mimics組及miR-NC組細(xì)胞粘附數(shù)均明顯增加(F=126.749、22.033，P<0.05)，20、40及60 min后miR-33a mimics組細(xì)胞粘附數(shù)分別為均低于miR-NC組[(194.65±22.31)個(gè)vs(256.33±26.32)個(gè)、(278.64±22.36)個(gè)vs(415.25±34.57)個(gè)、(303.25±34.78)個(gè)vs(657.45±54.23)個(gè)，P均<0.05]。見(jiàn)圖3。

3 討論

胃癌是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，是由多種因素共同影響及作用而誘導(dǎo)產(chǎn)生的高異質(zhì)性和復(fù)雜性腫瘤疾病[9]。近年來(lái)，隨著臨床綜合治療方案的不斷發(fā)展，胃癌的病死率明顯降低，但是胃癌晚期患者的預(yù)后依然較差，其術(shù)后5年生存率僅為20%，嚴(yán)重威脅患者的生命健康[10]。

圖3 miR-33a對(duì)胃癌細(xì)胞粘附的影響(×100)

腫瘤細(xì)胞的增殖、遷徙、侵襲及凋亡等多種生物學(xué)行為是導(dǎo)致胃癌患者病死率居高不下的關(guān)鍵因素，因此研究胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中各項(xiàng)生物學(xué)功能對(duì)于胃癌的防治具有重要的意義[11]。

研究證實(shí)，miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)機(jī)體基因的表達(dá)，參與腫瘤發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中的生命活動(dòng)，包含腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡等[12]。miR-33a為miR-33兩種亞型中的一種，被證實(shí)在結(jié)腸癌、胰腺癌、肝癌、宮頸癌等各類腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)[13]。Karatas等[14]研究顯示，在淋巴瘤、肝癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等腫瘤細(xì)胞中miR-33a表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織，miR-33a能發(fā)揮抑癌基因的作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。在本研究中，通過(guò)對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中miR-33a表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織，提示miR-33a與胃癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，與Wang等[15]研究結(jié)果相符。

為了進(jìn)一步研究miR-33a在胃癌細(xì)胞生物學(xué)功能中的作用，本研究選取人胃癌細(xì)胞株SGC-7907為研究對(duì)象，以脂質(zhì)體為載體將人工合成的miR-33a轉(zhuǎn)染至SGC-7907細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)miR-33a在SGC-7907細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)。腫瘤細(xì)胞的惡性增殖的癌癥進(jìn)一步發(fā)展的基礎(chǔ)，本研究發(fā)現(xiàn)相比較于正常SGC-7907細(xì)胞，轉(zhuǎn)染miR-33a可明顯抑制細(xì)胞增殖能力，提示miR-33a基因在胃癌中能發(fā)揮抑癌的作用。Tsai等[16]亦通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-33a參與胃癌細(xì)胞的增殖過(guò)程，上調(diào)miR-33a基因表達(dá)能顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力，實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用。一方面，miR-33a可以靶向細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6(CDK6)，通過(guò)下調(diào)CDK6影響細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞胃癌細(xì)胞增殖[17]。另一方面，miR-33a還可以通過(guò)抑制原癌基因Pim-1表達(dá)產(chǎn)物Pim-1蛋白抑制胃癌細(xì)胞增殖[18]。

腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲是影響胃癌患者預(yù)后的關(guān)鍵因素之一，其主要通過(guò)多步驟的連續(xù)過(guò)程得以實(shí)現(xiàn)[19]。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲過(guò)程首先是腫瘤細(xì)胞從原發(fā)病灶部位脫落，隨后進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，遷移至特定器官或組織上進(jìn)行粘附，進(jìn)入血管壁后定居，進(jìn)一步分化、增殖形成轉(zhuǎn)移灶[20]。Nouraee等[21]將miR-33a基因轉(zhuǎn)染于食管癌細(xì)胞中，以未經(jīng)轉(zhuǎn)染的食管癌細(xì)胞作為對(duì)照，經(jīng)對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)miR-33a基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞的遷移及侵襲能力具有明顯的抑制作用，說(shuō)明miR-33a能抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移及侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，向SGC-7907細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-33a后，其細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲能力均明顯降低，說(shuō)明miR-33a能有效抑制胃癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移及侵襲。有學(xué)者認(rèn)為，當(dāng)腫瘤細(xì)胞的粘附能力受到抑制時(shí)，脫落的腫瘤細(xì)胞因粘附受阻而在循環(huán)系統(tǒng)中凋亡，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲能力[22]。在本研究中，轉(zhuǎn)染miR-33a的SGC-7907細(xì)胞的粘附能力明顯下降，而其相應(yīng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲能力均明顯降低，也就是說(shuō)抑制miR-33a發(fā)揮對(duì)SGC-7907細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲能力的抑制作用是通過(guò)降低其粘附能力實(shí)現(xiàn)的。提升miR-33a基因表達(dá)后，SGC-7907細(xì)胞粘附力受到明顯抑制，使其無(wú)法粘附在特定的器官及組織上，從而無(wú)法實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步增殖及分化，抑制其轉(zhuǎn)移及侵襲的能力[23]。

綜上所述，miR-33a在胃癌組織中低表達(dá)，上調(diào)miR-33a表達(dá)量能明顯抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及粘附能力，提示miR-33a對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)性能產(chǎn)生明顯影響，有望成為胃癌治療的新靶點(diǎn)。