吳雷琪,李鳴遠(yuǎn),李倩,米娜瓦爾·胡加艾合買提

原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)是一種慢性的進(jìn)行性肝病，其發(fā)病特點(diǎn)是免疫介導(dǎo)的肝內(nèi)小膽管的進(jìn)行性炎癥性破壞，導(dǎo)致膽汁淤積，纖維化，肝硬化，并最終致使肝功能衰竭，由于線粒體/核蛋白相關(guān)的自身抗體與PBC發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，因此也被認(rèn)為是器官特異性自身免疫性疾病[1-3]。盡管大量研究表明遺傳因素能夠?qū)е录膊∫赘行院蛧?yán)重程度[4]，但PBC的發(fā)病原因仍然知之甚少。

UGT1A1是膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(B-UGT)的編碼基因，其影響B(tài)-UGT的活性并參與肝臟中膽紅素葡萄糖醛酸化反應(yīng)。研究表明，UGT1A1突變與膽囊結(jié)石和肝內(nèi)膽管結(jié)石的形成密切相關(guān)[5-6]，其機(jī)制可能是UGT1A1基因突變引起膽紅素代謝障礙，從而改變膽汁中雙結(jié)合膽紅素、單結(jié)合膽紅素及游離膽紅素的構(gòu)成比例，最終促使成石膽汁形成。由于PBC患者血清中膽紅素水平通常會(huì)升高，而膽紅素的代謝與UGT1A1基因的多態(tài)性有關(guān)[7-8]，因此推測UGT1A1多態(tài)性可能影響原發(fā)性膽汁性肝硬化的發(fā)生。而UGT1A1基因突變通常位于第一外顯子211 bp處的G/A堿基(UGT1A1*6位點(diǎn))，分為GG、GA和AA三種基因型，且僅發(fā)生在亞洲人群中[9]。因此，為研究漢族和維吾爾族PBC患者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與UGT1A1基因多態(tài)性的聯(lián)系，本研究收集2013年9月至2018年3月收住本院的PBC患者的臨床資料及血液樣本，檢測UGT1A1基多態(tài)性與PBC發(fā)病的相關(guān)性，為原發(fā)性膽汁性肝硬化的防治提供更多的臨床依據(jù)。

1 材料方法

1.1 材料

血液基因組DNA提取試劑盒購、DNA純化試劑盒及瓊脂糖均購自美國sigma公司；PCR擴(kuò)增試劑盒(包括2×buffer緩沖液、dNTPs、MgSO4和高保真酶)購自日本takara公司。

1.2 樣本資料

本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，收集2013年9月-2018年3月我院就診的PBC患者共159例，其中漢族PBC患者117例、包括男52例、女65例，平均年齡(56.1±8.42)歲；維吾爾族PBC患者42例，包括男19例、女23例，平均年齡(54.5±9.11)歲。所有PBC患者符合美國肝病研究學(xué)會(huì)(AASLD)的PBC診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。根據(jù)肝活檢結(jié)果和臨床表現(xiàn)，將PBC患者分為早期PBC患者：活檢證實(shí)Scheuer1期、2期或沒有任何體征表明有門靜脈高壓或肝硬化；以及晚期PBC患者：活檢證實(shí)Scheuer3期、4期或有跡象表明門靜脈高壓，肝硬化或出現(xiàn)持續(xù)性黃疸。漢族早期和晚期PBC患者分別為78例和39例，維吾爾族早期和晚期PBC患者分別為25例和17例。選擇同期于我院就診的182例健康體檢人群作為對(duì)照組，其中145例為漢族，包括男82例、女63例，平均年齡(52.9±8.01)歲；37例為維吾爾族，包括男22例、女15例，平均年齡(54.8±8.35)歲。PBC患者及對(duì)照組之間年齡、性別均無顯著性差異(P>0.05)，所有入選的研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.3 UGT1A1基因多態(tài)性檢測

采用含有EDTA的離心管收集PBC患者及對(duì)照組人群的外周靜脈血，并置于-20 ℃保存。提取全血基因組DNA并利用PCR結(jié)合測序分型技術(shù)檢測UGT1A1基因的多態(tài)性。用于UGT1A1基因UGT1A1*6位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增的上游引物F：5′-ACGCCTCGTTGTACATCAGAG-3′, 下游引物R：5′-TCCTTGTTGTGCAGTAAGTGG-3′。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增UGT1A1基因，20 μL反應(yīng)體系包括：40 ng基因組DNA、10×反應(yīng)緩沖液2 μL、2 mM dNTPs 2 μL、25 mM MgSO4μL、上下游引物各0.5 μL、高保真酶0.5 μL、滅菌雙蒸水補(bǔ)齊體系至20 μL。擴(kuò)增后，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并送至上海生工公司測序。UGT1A1基因的3種基因型分別為G/G、G/A和A/A，根據(jù)測序結(jié)果對(duì)PBC患者及健康人群的UGT1A1基因型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 UGT1A1基因UGT1A1*6位點(diǎn)的遺傳平衡性檢測及基因分型結(jié)果

根據(jù)測序結(jié)果統(tǒng)計(jì)UGT1A1基因UGT1A1*6位點(diǎn)的3種基因型頻率，如圖1和表1所示。漢族和維吾爾族健康人群和PBC患者的UGT1A1的基因型分布均達(dá)到遺傳平衡(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，具有群體代表性。

圖1 UGT1A1基因 UGT1A1*6位點(diǎn)的基因型測序分型結(jié)果

民族組別nGGGAAA 2值P值漢族對(duì)照組14575(51.7)28(19.3)42(29.0)33.7770.001PBC組11721(17.9)49(41.9)47(40.2)維吾爾族對(duì)照組3719(51.4)8(21.6)10(27.0)7.8330.020PBC組4210(23.8)20(47.6)12(28.6)

漢族PBC患者的GA和AA基因型頻率均高于對(duì)照組人群(41.9%vs19.3%，40.2%vs29.0%)，維吾爾族PBC患者的GA基因型頻率高于對(duì)照組人群(47.6%vs21.6%)，且漢族和維吾爾族對(duì)照組健康人群與PBC患者之間的基因型分布均存在顯著性差異(P均< 0.05)，提示UGT1A1*6的GA和AA基因型可能與漢族和維吾爾族人群的PBC發(fā)病有關(guān)。

2.2 漢族及維吾爾族人群UGT1A1基因在PBC早、晚期的基因型分布及比較

如表2所示，比較分析漢族及維吾爾族PBC患者UGT1A1基因的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)其UGT1A1*6位點(diǎn)的三種基因型分布無顯著性差異(P>0.05)，提示PBC發(fā)病與漢族和維吾爾族人群UGT1A1基因的多態(tài)性無關(guān)，無地區(qū)和人種限制。進(jìn)一步分析早、晚期PBC患者UGT1A1*6的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)漢族和維吾爾族早期PBC患者UGT1A1*6的基因型分布無明顯差異(P>0.05)，而漢族和維吾爾族晚期PBC患者UGT1A1*6的基因型分布呈顯著性差異(P<0.05)，其中漢族PBC患者的GG基因型頻率17.9%明顯高于維吾爾族0%，而其GA基因型頻率38.5%則明顯低于維吾爾族70.6%，表明相較于漢族PBC患者，含有UGT1A1*6 GA基因型的PBC患者人群更易出現(xiàn)在維吾爾族人群中，提示漢族及維吾爾族人群PBC的晚期發(fā)病與UGT1A1*6基因型分布有關(guān)。

表2 漢族與維吾爾族PBC患者UGT1A1*6位點(diǎn)基因型頻率的比較分析 [n(%)]

3 討論

原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)為慢性進(jìn)行性的非化膿性膽管炎性疾病。隨著環(huán)境的污染和生活方式的西化，以及該疾病知識(shí)的普及，PBC的檢出率逐年上升[11]。目前研究認(rèn)為，PBC是在經(jīng)免疫介導(dǎo)的環(huán)境和遺傳基因等因素共同作用下發(fā)生的，基因因素導(dǎo)致的疾病易感性在其發(fā)病機(jī)制中作用重大[12]。UGT1A1基因負(fù)責(zé)編碼UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶，能夠通過葡萄糖醛酸化途徑將小親脂性分子如類固醇，膽紅素，激素和藥物轉(zhuǎn)化為水溶性可排泄代謝物[13-14]。研究表明，UGT1A1基因編碼的蛋白對(duì)于自身免疫性肝炎2型患者的抗UGT陽性血清具有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)[15]。以上依據(jù)提示，UGT1A1基因可能參與自免疫調(diào)節(jié)，并通過自免疫機(jī)制參與肝臟中膽汁的排放。而迄今為止，并未有研究報(bào)道UGT1A1基因與PBC發(fā)病的關(guān)系。本研究通過采集PBC患者和健康人群的血液DNA進(jìn)行UGT1A1的基因多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)漢族PBC患者的GA和AA基因型頻率均高于對(duì)照組人群，維吾爾族PBC患者的GA基因型頻率高于對(duì)照組人群，且漢族和維吾爾族對(duì)照組健康人群與PBC患者之間的基因型分布均存在顯著性差異，提示UGT1A1*6的GA和AA基因型可能與漢族和維吾爾族人群的PBC發(fā)病有關(guān)。

大量研究報(bào)道，UGT1A1基因多態(tài)性能夠反應(yīng)結(jié)直腸癌、肺癌和婦科癌癥等患者治療過程中伊立替康誘導(dǎo)的毒性，而僅在伊立替康治療的韓國結(jié)腸癌患者中發(fā)現(xiàn)UGT1A1基因UGT1A1*6突變體與患者白細(xì)胞嚴(yán)重減少相關(guān)[16-19]，提示UGT1A1基因多態(tài)性可能影響患者的藥物排泄功能且與患者種族相關(guān)。本研究通過比較漢族和維吾爾族PBC患者的UGT1A1基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)UGT1A1*6位點(diǎn)的三種基因型在漢族和維吾爾族人群中無顯著性差異，提示UGT1A1基因多態(tài)性與PBC發(fā)病的關(guān)系可能不受地區(qū)和人種的限制，這與羅德梅等[20]的報(bào)道一致。孟新艷等[21]通過檢測漢族和維吾爾族PBC患者的GP210、sp100和AMA-M2抗體，發(fā)現(xiàn)GP210和SP100在維吾爾族PBC患者中的陽性率顯著高于漢族，提示維族人群更易發(fā)生PBC。本研究發(fā)現(xiàn)盡管UGT1A1基因多態(tài)性與漢族和維族總體PBC患者的發(fā)病無關(guān)，但在晚期PBC患者中，GA基因型的維族PBC患者比例明顯高于漢族，且具有顯著性差異，提示UGT1A1基因多態(tài)性與晚期PBC的發(fā)生與人種和地區(qū)有關(guān)，提示含有GA基因型的維吾爾族人群更易加劇PBC的惡化。

綜上所述，本研究通過分別比較PBC患者和健康人群、及早、晚PBC患者UGT1A1基因在不同種族中的多態(tài)性，證實(shí)UGT1A1*6位點(diǎn)的基因型分布與漢族和維吾爾族PBC患者的遺傳易感性和發(fā)病相關(guān)，且含有GA基因型的晚期PBC患者更易發(fā)生在維吾爾族人群中，為PBC治療提供一定的理論依據(jù)。