常威，劉海鴻，薛海貴

胃癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的常見惡性腫瘤之一[1-2]，據(jù)統(tǒng)計我國每年胃癌新發(fā)患者達70萬人[3-4]，由于胃癌的發(fā)病隱匿且診斷水平有限，大多數(shù)胃癌患者在確診時已經(jīng)發(fā)展為中晚期，失去了手術機會，即使早期胃癌患者在接受手術治療后仍有可能發(fā)生局部復發(fā)或遠處轉移，導致治療失敗[5-6]。因此近年來的研究都集中在尋找新的藥物靶點，旨在為胃癌的治療尋找新的突破。

miRNA是一類微小非編碼 RNA，其長約 20～22個核苷酸[7-8]。多項研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 可通過結合靶基因3’的非編碼區(qū)調(diào)節(jié)目的基因的轉錄和蛋白翻譯，參與惡性腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡等多個生物學過程，可發(fā)揮癌基因和抑癌基因的功能[9-10]。隨著近年不斷深入的研究，miRNA 在多種腫瘤中表達異常。蔡輝等[11]發(fā)現(xiàn)miR-221在早期胃癌患者血漿中明顯升高，并且可作為早期胃癌檢測的生物標志物，提示miR-221在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。國內(nèi)外關于miR-221對胃癌細胞增殖的能力及機制的研究較少，本文通過檢測健康人和胃癌患者組織中miR-221的表達，同時運用反義基因技術靶向抑制胃癌細胞中miR-221的表達，檢測其對增殖能力的影響，并探討其相關的機制，為尋找治療胃癌的新靶點提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本研究納入我院2015年6月至2017年7月就診的48例胃癌患者、32例同期體檢健康者作為研究對象。胃癌患者納入標準：①年齡18～70歲，男女不限；②經(jīng)組織學或細胞學確診為胃癌；③患者術前未進行化療、放療或靶向治療；④未合并其他惡性腫瘤，無遠處轉移；⑤無嚴重感染；⑥自愿參加試驗，并同意簽署知情同意書。排出標準：①合并嚴重的心腦血管疾病；②合并嚴重的肝腎功能疾??；③有精神類疾病，依從性差；④妊娠期或哺乳期婦女。胃癌患者與健康者的一般資料如下表1，經(jīng)統(tǒng)計學分析，兩組研究對象在年齡、性別比例、實驗室檢查指標的差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，具有可比性。

表1 兩組的一般資料的比較

1.2 方法

1.2.1 主要試劑

胃癌細胞SGC-7901、正常胃上皮細胞GES-1購買于上海ATCC細胞庫，細胞培養(yǎng)液RPMI1640、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(含EDTA)均為美國Hyclone公司產(chǎn)品，青-鏈霉素雙抗為美國Sigma公司產(chǎn)品，Western blotting 中STAT3一抗、二抗均為美國Cell signaling 公司產(chǎn)品；RNA提取試劑Trizol Reagent、瞬時轉染Lipo2000為美國Invitrogen 公司產(chǎn)品，RT-PCR、BCA試劑盒為日本Takara 公司產(chǎn)品，MTT試劑盒由南京建成生物提供，miR-221、U6引物由深圳華大基因公司合成，miR-221 mimics、anti-miR-221、對照miRNA由蘇州吉凱生物提供，蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、蛋白裂解液為北京碧云天生物公司產(chǎn)品，miR-221和內(nèi)參引物見表2。

1.2.2 細胞培養(yǎng)

將胃癌細胞SGC-7901培養(yǎng)在含細胞培養(yǎng)基中(含10%的胎牛血清)，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中，待細胞生長至80%～90%時傳代培養(yǎng)，用于后續(xù)的實驗，采用普通光學顯微鏡觀察胃癌細胞SGC-7901(圖1)。

1.2.3 組織和細胞miR-221的檢測

取適量的組織，加入到研磨器中，研磨過程中加入適量的液氮，充分研磨組織，運用Trizol 提取細胞和組織總RNA后，根據(jù)Takara逆轉錄試劑盒的操作說明將 RNA逆轉錄為 cDNA，然后將 cDNA 為作為PCR 的模板，加入miR-221引物進行PCR 反應，根據(jù)公式ΔCt=CtmiR-221-CtmiRNA-U6計算各樣本中miR-221的含量，逆轉錄和RT-PCR反應體系見表3、4。

表2 各基因的上下游引物

圖1 胃癌細胞SGC-7901的形態(tài)學(20×)

表3 逆轉錄反應體系

表4 實時熒光定量PCR反應體系

1.2.4 瞬時轉染

將胃癌細胞SGC-7901接種于細胞培養(yǎng)皿中，分為4組，組1(mimics對照組)、組2(hsa-miR-221組)、組3(anti-miR組)、組4(anti-miR-221)，待細胞長至70%～80%時，棄去細胞培養(yǎng)液。4組加入 250 μL Opti-MEMLipo2000 和對照mimics、hsa-miR-221混合物、anti-miR、anti-miR-221，混合均勻放置5 min后換液，加入含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，RT-PCR檢測miR-221的表達，觀察轉染效果。

1.2.5 MMT實驗

將步驟4中處于對數(shù)生長期的細胞接種于96孔板中，設置第1天、2天、3天、4 天、5天共5組，每組設置3個復孔。細胞培養(yǎng)2～4 h細胞貼壁后加入10 μL的MTT，輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去孔中的混合物，加入150 μL DMSO，分別檢測450 nm的吸光值，根據(jù)獲得的數(shù)據(jù)繪制細胞的生長曲線。

1.2.6 蛋白印跡法(Western blotting)法檢測STAT3相關蛋白的表達

采用BCA試劑盒對兩組細胞進行定量，配平后加入適量的5xLoading buffer后，100 ℃煮沸5 min變性，制作SDS-PAGE凝膠，加入適量的變性蛋白進行電泳，電泳完成后將蛋白轉至PVDF膜，采用3%的BSA液進行封閉，TBST液洗膜后按照1∶1 000的比例加入相應的一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，按照1∶2 000加入二抗，孵育1 h，TBST洗膜3次，按照ECL試劑盒進行曝光顯色，重復實驗3次，采用Image J軟件計算各條帶的灰度值，并比較兩組細胞STAT3的差異。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 不同胃組織miR-221陽性表達情況比較

如表5所示，胃癌組織的miR-221陽性表達率明顯高于癌旁組織、正常組織(均P<0.05)，癌旁組織高于正常的miR-221陽性表達率，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 正常胃上皮細胞和胃癌細胞SGC-7901細胞中miR-221的表達

如圖2所示，與正常胃上皮細胞中miR-221表達水平(4.56±1.21)相比，胃癌細胞的miR-221表達水平(15.32±2.74)明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.222，P=0.003)。

表5 不同胃組織miR-221陽性表達情況比較 [n(%)]

圖2正常胃上皮細胞和SGC-7901細胞中miR-221表達水平比較

2.3 四組細胞中miR-221的表達的比較

如圖3所示，組1(mimics對照組)、組2(hsa-miR-221組)、組3(anti-miR組)、組4(anti-miR-221組) 細胞miR-221的表達水平分別為3.49±1.15、14.36±2.81、3.18±1.26、0.58±0.16。其中組2細胞miR-221表達水平最高，組4細胞miR-221表達水平最低，組1和組3兩組無明顯差異，提示瞬時轉染成功。

圖3四組細胞miR-221的表達水平對比 四組比較，F(xiàn)=41.39，P=0.000；*與組1相比，P<0.05；△與組2相比，P<0.05；#與組3相比，P<0.05

2.4 miR-221對SGC-7901細胞增殖的影響

如圖4所示，組1(mimics對照組)、組2(hsa-miR-221組)、組3(anti-miR組)、組4(anti-miR-221)中組2的增殖能力最強，組4的增殖能力最弱，組1和組3兩組無明顯差異(P>0.05)。

圖4四組細胞增殖能力的對比 與組2、組3比較，*P<0.05，**P<0.01

2.5 miR-221對STAT信號通路的影響

如下圖5、圖6所示，組1(mimics對照組)、組2(hsa-miR-221組)、組3(anti-miR組)、組4(anti-miR-221組) STAT3蛋白表達水平分別為0.341±0.028、0.748±0.052、0.376±0.031、0.218±0.022。其中組2的STAT3蛋白表達水平最高，組4 STAT3表達水平最低，組1和組3兩組無明顯差異(P>0.05)。

圖5 四組細胞STAT3和GAPDH蛋白的表達

圖6四組細胞中STAT3的相對表達量 四組比較，F(xiàn)=127.00，P=0.000；*與組1相比，P<0.05；△與組2相比，P<0.05；#與組3相比，P<0.05

3 討論

胃癌是我國常見的惡性消化道腫瘤之一，近年來其總體發(fā)病率呈逐年上升趨勢，大多數(shù)胃癌發(fā)現(xiàn)時已到中晚期，且治療手段有限，因此提高胃癌的早期診斷率和臨床療效具有重要的社會和科學價值。

研究發(fā)現(xiàn)miRNA在各類生物中均有表達，由20～22個堿基構成的非編碼的小分子RNA，通過靶向結合目的基因3’非編碼區(qū)，調(diào)節(jié)轉錄過程，影響其蛋白的合成和表達，參與調(diào)控生物體的生長、發(fā)育、增殖、分化等多個生物學過程。最新研究發(fā)現(xiàn)，miR-221在肝細胞癌、胃癌、結直腸癌、肺癌等多種惡性腫瘤表達水平明顯升高[12-15]，因而研究miRNA在胃癌中的功能闡明其在胃癌發(fā)生和發(fā)展中的分子機制，為尋找更為精確的診斷方法和新的靶向治療方法提供必要的理論基礎。

王偉等[16]曾發(fā)現(xiàn)靶向抑制miR-221可抑制結直腸癌細胞的增殖并促進凋亡，miR-221對胃癌細胞增殖能力的影響鮮有報道，因此本研究通過檢測不同組織和細胞中miR-221的表達，結果顯示，與正常胃組織和癌旁組織相比，胃癌組織中miR-221的表達顯著升高，胃癌細胞中miR-221的表達趨勢與組織中的一致，提示miR-221在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用。

STAT3 信號通路通過介導多個生長因子和細胞因子參與細胞的增殖、分化和凋亡的過程，此信號的過度活化可引起細胞的異常增殖，在乳腺癌、胃癌、結直腸癌等惡性腫瘤中表達明顯升高[17-19]。Liu S等[20]均發(fā)現(xiàn)miR-221通過調(diào)控STAT3信號通路影響結直腸癌細胞的增殖和凋亡。本研究運用MTT檢測過表達miR-221和靶向抑制miR-221對細胞增殖能力的影響，結果表明，過表達miR-221可明顯促進胃癌細胞的增殖，而下調(diào)miR-221可明顯抑制胃癌細胞的增殖，同時運用免疫印跡法檢測STAT3蛋白的表達水平，結果顯示，過表達miR-221可明顯促進STAT3蛋白的表達，而下調(diào)miR-221的表達可抑制STAT3蛋白的表達，提示miR-221可能通過激活STAT3信號通路促進胃癌細胞的增殖。miR-221相關的靶基因很多，因此否還存在其他信號通路參與還需進一步研究。