靳文，鄢文，李冬義，陳潔瓊，趙雅紅

慢性腎功能不全(chronic renal insufficiency，CRI)是指各種慢性腎臟病的嚴(yán)重和/或終末階段，以腎功能不可逆地喪失、水、電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂、體內(nèi)代謝產(chǎn)物和毒素潴留、內(nèi)分泌功能失調(diào)、合并多器官功能損害為主要臨床特征的綜合征，是我國(guó)居民疾病構(gòu)成和死亡原因的重要組成部分[1-2]。心血管疾病是CRI的最常見并發(fā)癥和不良預(yù)后的重要影響因素[3-4]。尿毒素硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate，IS)主要由腸道微生物來源的色氨酸酶介導(dǎo)色氨酸生成吲哚，最終在肝臟內(nèi)代謝生成[5]。已有臨床研究證實(shí)IS是CRI并發(fā)心血管不良事件的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[6]?；A(chǔ)研究表明IS通過觸發(fā)心肌組織炎癥、心肌纖維化、心肌細(xì)胞肥大和凋亡等作用促進(jìn)心力衰竭的發(fā)生發(fā)展[7-10]。本研究通過構(gòu)建5/6腎大部分切除術(shù)構(gòu)建CRI大鼠模型，旨在探討NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(Nod-like receptor family pyrin domain-containing 3，NLRP3)炎性小體在CRI大鼠心肌組織中的表達(dá)和潛在作用。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

本實(shí)驗(yàn)選擇220～250 g SD大鼠[購(gòu)買自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為：SCXK (粵)2016-0041]為研究對(duì)象。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、CRI組。CRI組予以行5/6腎大部分切除術(shù)。以上每組20只大鼠。本實(shí)驗(yàn)研究嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)章，并在經(jīng)廣東省第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后開展研究。

1.2 5/6腎大部分切除術(shù)建立CRI大鼠模型

SD大鼠行5/6腎大部分切除術(shù)建立CRI大鼠模型，簡(jiǎn)要操作步驟如下：予以3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，予以仰臥位固定四肢，行氣管插管并予以小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸。沿大鼠腹中線作切口，依次剪開皮膚、筋膜、肌肉、腹膜，撕開左腎包膜，暴露左腎動(dòng)脈及其分支血管，結(jié)扎兩支前側(cè)分支血管中的一支及背側(cè)分支血管，以觀察到腎臟明顯變白為準(zhǔn)。術(shù)后逐層縫合組織。予以碘伏消毒皮膚切口。2周后以相同手術(shù)操作方式行右腎全切除，4周后成模。觀察手術(shù)切口有無感染。若存在感染，可予以腹腔注射青霉素15萬單位，連續(xù)應(yīng)用3天。造模后8周用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.3 大鼠腎功能和IS的檢測(cè)

分別采用苦味酸速率比色法檢測(cè)血漿肌酐(SCr)、脲酶波氏比色法檢測(cè)血尿素氮(BUN)的表達(dá)。具體操作參考試劑盒說明書。采用高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)血清IS的濃度。

1.4 心臟超聲檢測(cè)大鼠心臟功能

各組大鼠均行心臟超聲檢測(cè)以觀察心臟結(jié)構(gòu)和功能。大鼠胸前備皮、3%戊巴比妥鈉麻醉固定，使用IE33彩色超聲檢測(cè)儀L15-7io模式(深度2.0 cm，速度60 mm/S)，經(jīng)左室長(zhǎng)軸獲2D，改M型模式，M線平行二尖瓣后基底部，以M型超聲測(cè)量和計(jì)算以下左心室指標(biāo)：左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index，LVMI)、舒張?jiān)缙诘亩獍暄魉俣?二尖瓣環(huán)運(yùn)動(dòng)速度(E/e′)。每只大鼠在每個(gè)切面上檢測(cè)2次，每次連續(xù)讀取5個(gè)心動(dòng)周期，取平均值。

1.5 Masson染色檢測(cè)心肌纖維化

常規(guī)操作脫蠟；把切片置于Masson染色液泡制4 min；浸泡冰醋酸溶液 1 min；置于磷鎢酸染5 min；0.2%冰醋酸洗滌2 min；以亮綠或苯膠藍(lán)液復(fù)染5 min；再把切片置于0.2%冰醋酸浸洗三次；即予中性樹膠把切片面封閉。顯微鏡下采取病理圖像。采用Image Pro Plus 6.0定量分析心肌纖維化比例=纖維化面積/心肌總面積。每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行分析。

1.6 蛋白印跡(Western blotting，WB)技術(shù)檢測(cè)左室心尖部心肌組織NLRP3、IL-1β的表達(dá)

WB技術(shù)檢測(cè)大鼠左心室心尖部心肌組織NLRP3、IL-1β的表達(dá)。以上目的蛋白抗體均購(gòu)買自Abcam公司。簡(jiǎn)要步驟如下：提取并檢測(cè)心肌組織蛋白濃度，取100 μg組織蛋白上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，用封閉液配制目的蛋白一抗(NLRP3、IL-1β)工作液，4 ℃下與膜孵育過夜后取膜于室溫下以1×TBST緩沖液清洗4次，每次5 min。接著以含有二抗的封閉液與膜孵育1 h，室溫下以1×TBST緩沖液清洗4次，每次5 min。最后加入化學(xué)發(fā)光底物，顯影，拍照。使用ImageJ軟件進(jìn)行檢測(cè)條帶灰度值與GAPDH的比值(磷酸化蛋白以磷酸化蛋白灰度值與相應(yīng)總蛋白灰度值比較)表示各組相應(yīng)蛋白的表達(dá)強(qiáng)度。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白的灰度值/內(nèi)參蛋白的灰度值。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 熒光定量PCR檢測(cè)心肌組織miR-34a的表達(dá)

TRIzol法提取各組心肌組織總RNA，參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems公司，美國(guó))說明書制備cDNA。miR-34a和U6內(nèi)參的上、下游引物均由廣州復(fù)能基因公司合成。miR-34a的引物序列：上游：5′-GCCTGGCAGTGTCTTAGCT-3′，下游：5′-GTGCAG-GGTCCGAGGTC-3′；U6的引物序列：上游：5′-CTCG-CTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAA-TTTGCGT-3′。對(duì)心肌組織miR-34a進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40循環(huán)。以內(nèi)參U6對(duì)miR-34a進(jìn)行歸一化處理。目的基因相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間樣本的比較采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。P<0.05時(shí)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRI大鼠心功能減退、IS濃度增加

檢驗(yàn)結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，CRI組大鼠血肌酐以及IS濃度增加(P<0.05)。心臟超聲檢查結(jié)果顯示：與假手術(shù)組大鼠相比，CRI大鼠的LVEF減退(P<0.05)，LVMI和E/e′升高(P<0.05)，見表1。

表1 大鼠心腎功能以及IS水平

2.2 CRI大鼠的心肌間質(zhì)纖維化比例和心肌細(xì)胞橫截面積增加

Masson染色結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，CRI組大鼠左室心肌間質(zhì)纖維化比例、心肌細(xì)胞橫截面積均表達(dá)增加(P<0.05)，見表2。

表2 大鼠左室心肌間質(zhì)纖維化比例和心肌細(xì)胞橫截面積

2.3 CRI大鼠左室心尖部心肌組織miR-34a、NLRP3以及IL-1β表達(dá)增強(qiáng)

定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，CRI大鼠左室心尖部心肌組織miR-34a的表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)；WB檢測(cè)結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比，CRI組大鼠左室心尖部心肌組織NLRP3以及IL-1β的表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)，見圖1、表3。

圖1 WB檢測(cè)左室心肌組織NLRP3和IL-1β的表達(dá)

組別nNLRP3IL-1βmiR-34a(2-ΔΔCT)假手術(shù)組201.02±0.101.01±0.051.00±0.04CRI組201.71±0.102.16±0.151.82±0.09t值--21.481-32.903-37.508P值-<0.001<0.001<0.001

2.4 血漿IS與心功能、miR-34a、心肌間質(zhì)纖維化比例和心肌細(xì)胞截面積、心尖部心肌組織NLRP3、IL-1β相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示：血漿IS與LVEF呈負(fù)相關(guān)(P=0.007)，與LVMI、E/e′、心肌間質(zhì)纖維化比例、心肌細(xì)胞橫截面積、心尖部心肌組織NLRP3、IL-1β、miR-34a等呈正相關(guān)(P<0.001)；提示IS可能是CRI介導(dǎo)心功能損傷的重要介質(zhì),見表4。

表4 血漿IS與心功能、miR-34a、心肌間質(zhì)纖維化比例和心肌細(xì)胞截面積、心肌組織NLRP3、IL-1β相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性分析

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)CRI大鼠血漿IS表達(dá)升高，LVEF降低、LVMI和E/e′升高，心肌間質(zhì)纖維化比例和心肌細(xì)胞橫截面積升高，組織中NLRP3、IL-1β以及miR-34a表達(dá)升高，提示IS可能是CRI引起心功能損傷的重要媒介。

人體腸道菌群主要由益生菌、中性菌以及病原菌等數(shù)千種細(xì)菌組成，通過產(chǎn)生大量具有生物活性的代謝物質(zhì)對(duì)機(jī)體的生理和病理生理功能產(chǎn)生影響。如益生菌能夠利用飲食中纖維、蛋白分解代謝產(chǎn)生維生素和氨基酸，有助于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收，發(fā)揮調(diào)控免疫、防控疾病等作用。中性菌和病原菌通過分解代謝產(chǎn)生有毒物質(zhì)如內(nèi)毒素等破壞腸道黏膜屏障功能并協(xié)同病原菌進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)損傷組織器官[11-12]。生理狀態(tài)下，這些腸道菌群數(shù)量和種類處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，與宿主腸道協(xié)同形成生理屏障以阻止腸道有害物質(zhì)進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，通過調(diào)控營(yíng)養(yǎng)和能量物質(zhì)代謝、免疫炎癥反應(yīng)和基因表達(dá)，參與機(jī)體多種生理過程[13-16]。近年來研究認(rèn)為腸道菌群與慢性腎臟疾病、心力衰竭等疾病密切相關(guān)[17-18]。在CRI狀態(tài)下，一方面尿毒癥毒素不僅可以直接損傷腸道粘膜屏障功能，還可對(duì)腸道菌群的組成、功能和代謝產(chǎn)生嚴(yán)重影響；另一方面，以IS為代表的尿毒素進(jìn)入循環(huán)進(jìn)一步加重CRI。

IS主要是由以大腸桿菌為主的腸道菌群通過分解代謝色氨酸生成吲哚，由微生物氧化酶氧化生成吲哚酚，最終通過肝內(nèi)磺化反應(yīng)生成進(jìn)入循環(huán)并通過腎臟代謝排出[5]。在CRI條件下，隨著腎功能的惡化，IS大量蓄積于體內(nèi)[6]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)于假手術(shù)組，5/6腎臟大部分切除術(shù)制備的CRI大鼠血漿IS濃度升高，心功能指標(biāo)如LVEF、LVMI和E/e′升高，IS濃度與LVEF負(fù)相關(guān)(r=-0.423，P=0.007)、與LVMI(r=0.794，P<0.001)和E/e′(r=0.507，P=0.001)正相關(guān)，進(jìn)一步提示IS對(duì)左室收縮功能和舒張功能均產(chǎn)生損害。病理結(jié)果顯示：相對(duì)于假手術(shù)組，CRI大鼠心肌間質(zhì)纖維化比例、心肌細(xì)胞橫截面積均顯著增加，IS濃度與心肌間質(zhì)纖維化比例、心肌細(xì)胞橫截面積均存在正相關(guān)。相關(guān)研究顯示IS能夠有效促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞纖維化、心肌細(xì)胞肥大[5-10]。本研究結(jié)合相關(guān)研究結(jié)果提示CRI大鼠存在舒張功能障礙，IS可能是CRI心臟功能損害的重要媒介。

miR-34a具有促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡、抑制心肌細(xì)胞肥大，促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞纖維化等作用[19-21]。在本研究中，CRI大鼠心肌組織miR-34a表達(dá)升高，與血漿IS濃度正相關(guān)(r=0.893，P<0.001)，提示IS的心臟損傷作用可能與miR-34a相關(guān)。NLRP3炎癥小體是心肌細(xì)胞肥大、心肌纖維化的重要調(diào)控分子[22]。已有研究證實(shí)IS能夠上調(diào)心肌組織NLRP3、IL-1β表達(dá)[10]，本研究發(fā)現(xiàn)血漿IS與心肌組織NLRP3、IL-1β表達(dá)呈正相關(guān)。以上研究提示血漿IS可能通過促進(jìn)心肌組織NLRP3炎性小體表達(dá)加劇心肌損傷。目前對(duì)于心肌組織NLRP3炎性小體與miR-34a表達(dá)之間的關(guān)系尚不清楚，仍需要進(jìn)一步進(jìn)行探討。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)血漿IS與CRI大鼠心功能損傷、NLRP3炎性小體表達(dá)、miR-34a表達(dá)等密切相關(guān)，提示IS可能通過NLRP3炎性小體、miR-34a促進(jìn)CRF心功能損傷。