王春玲，張榮芳，陳峰杰，周 露，姬穎華

(河南護理職業(yè)學院1護理系，2教務處，3藥理學教研室，4基礎護理教研室，河南 安陽 455000；5新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，河南 衛(wèi)輝 453100)

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，亞洲和非洲是肝癌的高發(fā)區(qū)[1-2]。據(jù)統(tǒng)計，2015年，我國約有4 292 000例肝癌新發(fā)病例，2 814 000例肝癌死亡病例，并且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[3]。雖然近年來對于肝癌的診斷和治療水平有所提高，但肝癌患者的5年內生存率依然很低[4]。高復發(fā)率是導致肝癌患者術后死亡的主要原因，并且腫瘤細胞轉移的具體分子機制還不清楚[5-6]。因此，探究肝癌細胞轉移的分子機制是尋找新的肝癌診斷及治療方法、增加肝癌患者生存時間及存活率的關鍵。大量研究表明，微小RNAs(microRNAs，miRNAs，miR)在細胞生長、增殖、凋亡和遷移過程中具有重要的調控作用，同時也可通過調控蛋白編碼基因的表達影響癌癥的發(fā)生和發(fā)展[7-8]。研究表明，人體有超過60%的蛋白質編碼基因上都具有miRNAs的結合位點[9]。miR-509是具有抑癌作用的miRNA，能夠抑制乳腺癌、卵巢癌和肺癌等多種腫瘤的轉移[10-12]。也有研究表明，miR-509高表達能抑制肝癌細胞生長[13]。但miR-509對肝癌細胞侵襲和遷移能力的影響還未見報道。本文以人肝癌細胞株LM3為研究對象，探究miR-509對肝癌的作用及作用機制。

材 料 和 方 法

1 試劑與儀器

DMEM細胞培養(yǎng)液、0.25%胰酶和胎牛血清均購自Gibco；miR-509模擬物(miR-509 mimic)和pcDNA Ras相關的C3肉毒毒素底物1(pcDNA Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, pcRac1)由上海吉瑪生物設計合成；Matrigel購自Invitriogen；抗Rac1抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠II抗購自Abcam(貨號分別為ab33186和ab6789); RIPA裂解液購自Sigma(貨號為R0278)；BCA試劑盒購自碧云天生物科技公司；Lipofectamine 2000轉染試劑盒購自Thermo Fisher(貨號為11668500)；Dual-Luciferase?報告基因試劑盒購自Promega(貨號為E1910)。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞株LM3購自中國科學院細胞庫。用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)LM3細胞。培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。細胞融合率達到85%以上時用0.25%胰酶進行消化傳代。

2.2細胞轉染 將細胞傳代培養(yǎng)于12孔板中，細胞密度為1×108/L。將細胞隨機分為LM3組、miR-509 mimic組、mimic+pcDNA組和mimic+pcRac1組。將細胞培養(yǎng)24 h后，根據(jù)轉染試劑盒說明書采用Lipofectamine 2000轉染miR-509 mimic和pcRac1到LM3細胞。轉染4 h后更換正常培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，48 h進行相關檢測。

2.3Western blot實驗 用RIPA蛋白裂解液于冰上提取各組細胞或組織蛋白，用BCA試劑盒檢測各組蛋白濃度并調平。每組取等量蛋白質用12% SDS-PAGE分離蛋白后，轉移蛋白質到PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白質2 h，以1∶1 000的濃度加入抗Rac1抗體，4 ℃孵育過夜。第2天棄去 I 抗，用緩沖液清洗PVDF膜后，加入 II 抗，室溫封閉1 h后，滴加ECL于暗室曝光顯影。實驗至少重復3次，以GAPDH為內參照。

2.4螢光素酶報告基因實驗 通過生物信息預測Rac1在miR-509序列上的結合片段，用RT-PCR擴增此結合片段，將該片段插入到pMIR-Report螢光素酶載體中，構建Rac1野生質粒；利用基因位點突變技術將結合片段中部分核苷酸突變，構建Rac1突變質粒。用Rac1野生質?；蛲蛔冑|粒與miR-509 mimic對LM3細胞進行共轉染，根據(jù)Dual-Luciferase?報告基因試劑盒說明書檢測各組螢光素酶活性。

2.5Transwell實驗 將轉染后細胞傳代接種于提前用Matrigel包被的Transwell小室上層，細胞密度為4×108/L，用不含胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，Transwell小室下層則加入正常細胞培養(yǎng)液。連續(xù)培養(yǎng)48 h后用無菌棉簽拭去小室上層細胞，用結晶紫將遷移至小室下層的LM3細胞染色，每組隨機選取5個視野對染色細胞進行基數(shù)統(tǒng)計。實驗至少重復3次，每組6個復孔。

2.6劃痕實驗 實驗前1 d用標記筆于12孔板背面畫出5條平行直線，消毒滅菌后備用。將LM3細胞以1×109/L的密度傳代培養(yǎng)于提前準備好的12孔板中，用miR-509 mimic和pc Rac1轉染細胞后，用10 μL槍頭垂直于培養(yǎng)板背面的橫線劃痕，用PBS清洗3次后，用無血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，隨機選取5個視野，檢測肝癌細胞遷移情況。

2.7肝癌裸鼠移植瘤(patient-derived xenograft,PDX)模型的建立 60只SPF級4周齡雄性BALB/c裸鼠購自北京維通利華實驗動物公司，許可證號為SCXK (京) 2014-0001。將裸鼠適應性喂養(yǎng)1周后進行實驗。用慢病毒轉染構建穩(wěn)定高表達miR-509的LM3細胞。將裸小鼠隨機分為LM3組和miR-509 mimic組。收集細胞并將細胞密度調整至5×109/L，于miR-509組小鼠右前部背部皮下注射穩(wěn)定表達miR-509的LM3細胞懸液，LM3組小鼠于相同位置注射未轉染的LM3細胞。連續(xù)飼養(yǎng)30 d，每天記錄小鼠存活情況，計算小鼠存活率,存活率(%)=存活小鼠數(shù)/每組小鼠總數(shù)×100%。

3 統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計學軟件SPSS 19.0對實驗結果進行統(tǒng)計分析，組間差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組間比較采用t檢驗。所有實驗結果均以均數(shù)±標準差 (mean±SD) 表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 miR-509對肝癌細胞Rac1表達的影響

與LM3組比較，miR-509 mimic組和mimic+pcDNA組LM3細胞Rac1蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；與mimic+pcDNA組比較，mimic+pcRac1組細胞的Rac1 表達水平顯著升高 (P<0.05)，見圖1，提示miR-509可能可靶向調控Rac1的表達。

Figure 1.The effect of miR-509 on the expression of Rac1 in LM3 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsLM3 group;#P<0.05vsmimic+pcDNA group.

圖1 miR-509對肝癌細胞Rac1蛋白表達的影響

2 miR-509與Rac1的靶向關系

生物信息預測結果表明，miR-509序列上存在Rac1的連續(xù)結合序列。螢光素酶報告實驗結果表明，miR-509 mimic能顯著減弱Rac1野生質粒的螢光素酶活性(P<0.05)；結合位點突變后，miR-509 mimic對Rac1突變質粒螢光素酶活性的調控作用消失，見圖2，表明miR-509可靶向結合Rac1。

Figure 2.The relationship between miR-509 and Rac1 determined by luciferase reporter assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsRac1 WT group.

圖2 miR-509與Rac1的靶向關系

3 miR-509對肝癌細胞侵襲能力的影響

Transwell實驗結果表明，與LM3組比較，miR-509 mimic組和mimic+pcDNA組侵襲細胞數(shù)明顯減少(P<0.05)； 與mimic+pcDNA組比較，mimic+pcRac1組侵襲細胞數(shù)明顯增多(P<0.05),見圖3，表明miR-509可通過抑制Rac1表達降低肝癌細胞侵襲能力。

4 miR-509對肝癌細胞遷移能力的影響

與LM3組比較，miR-509 mimic組和mimic+pcDNA組肝癌細胞劃痕愈合率明顯降低(P<0.05)；用miR-509 mimic和pcRac1同時轉染細胞后，細胞劃痕愈合率顯著升高，與mimic+pcDNA組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖4。

5 miR-509對肝癌模型小鼠存活率及對腫瘤組織Rac1表達的影響

與LM3組比較，miR-509 mimic組裸鼠存活率明顯升高(P<0.05),見圖5，表明miR-509 mimic能促進肝癌模型小鼠存活。同時，miR-509 mimic還能顯著降低腫瘤組織Rac1的表達水平(P<0.01)，見圖6，表明miR-509可能通過抑制Rac1表達促進肝癌模型小鼠存活。

Figure 3.The effect of miR-509 on the invasion ability of LM3 cells determined by Transwell assay (×200). Mean±SD.n=6.*P<0.05vsLM3 group;#P<0.05vsmimic+pcDNA group.

圖3 miR-509對肝癌細胞侵襲能力的影響

Figure 4.The effect of miR-509 on the migration of LM3 cells determined by wound healing assay (×100). Mean±SD.n=6.*P<0.05vsLM3 group;#P<0.05vsmimic+pcDNA group.

圖4 miR-509對肝癌細胞遷移能力的影響

Figure 5.The effect of miR-509 on the survival of hepatocellular carcinoma model mice. Mean±SD.n=15.*P<0.05vsLM3 group.

圖5 miR-509對肝癌模型小鼠存活率的影響

Figure 6.The effect of miR-509 on the expression of Rac1 in tumor tissue of hepatocellular carcinoma measured by Western blot. GAPDH was used as loading control. Mean±SD.n=8.**P<0.01vsLM3 group.

圖6 miR-509對肝癌腫瘤組織Rac1表達的影響

討 論

大量研究表明，miRNAs在多種生物學過程中發(fā)揮重要作用，包括細胞生長、分化及遷移等[14]。miRNAs在多類腫瘤中的異常表達表明miRNAs可能與腫瘤的發(fā)生也密切相關。如microRNA-204和microRNA-30c-2-3p在乳腺癌中表達異常降低[15-16]；microRNA-301a和microRNA-484在乳腺癌中表達升高[17]；microRNA-192和microRNA-506等在結腸癌細胞中表達水平低于正常結腸細胞[18-19]。miR-509等在肝癌細胞中也呈低表達狀態(tài)，但關于miR-509對肝癌侵襲和轉移能力的作用及作用機制還未見報道[13]。Chen等[20]的研究表明，miR-509-3p可通過靶向調控凋亡蛋白Bcl-2的表達增強順鉑誘導的卵巢癌細胞凋亡的作用。miR-509還可通過調控PODXL抑制胃癌細胞侵襲和遷移[21]。本文采用miR-509 mimic提高miR-509在肝癌細胞LM3中的表達水平發(fā)現(xiàn)，miR-509 mimic能抑制肝癌細胞侵襲和遷移，同時還能促進肝癌皮下移植瘤模型小鼠的存活，表明miR-509在肝癌中發(fā)揮著抑癌的作用。

此外，miR-509 mimic能顯著降低肝癌細胞中Rac1的蛋白表達水平，pcRac1能減弱miR-509 mimic對Rac1表達的抑制作用，提示miR-509可能可靶向抑制肝癌細胞LM3 Rac1的表達。通過生物信息預測發(fā)現(xiàn)miR-509基因序列上存在Rac1的靶向結合位點，螢光素酶報告基因實驗進一步表明miR-509可靶向結合Rac1。

Rac1是調控細胞骨架重組的關鍵調控分子，在細胞運動過程中發(fā)揮著至關重要的作用[22]。研究表明，Rac1的表達水平和活性在多類腫瘤中均明顯升高，能促進腫瘤的轉移[23]。研究發(fā)現(xiàn)，Rac1與肺癌患者的預后密切相關，抑制Rac1活性可抑制肺癌細胞轉移[24-25]。已有研究表明miR-509-3p可通過靶向調控Rac1表達抑制肺癌細胞增殖[26]。長鏈非編碼RNA可通過抑制miR-509表達上調Rac1活性，從而促進骨肉瘤癌細胞轉移[27]。本文研究發(fā)現(xiàn)，上調Rac1的表達能顯著減弱miR-509 mimic對肝癌細胞侵襲的抑制作用，表明miR-509抑制肝癌細胞侵襲的作用與下調Rac1表達有關。此外，pcRac1能明顯減弱miR-509 mimic對肝癌細胞遷移的抑制作用，進一步表明miR-509可通過靶向抑制肝癌LM3細胞Rac1的表達抑制癌細胞的轉移。

綜上所述，miR-509能抑制肝癌細胞Rac1表達，并能抑制肝癌細胞侵襲和遷移，上調Rac1表達能明顯減弱miR-509對肝癌細胞侵襲和遷移的抑制作用。本文對miR-509對肝癌細胞侵襲和遷移的作用和作用機制進行探討，可能為臨床尋找治療肝癌及減緩肝癌發(fā)展的方法提供了新的思路。