封潔珠, 李恩澤, 彭子瀚, 裴一飛, 朱林燕△, 高綠芬

(暨南大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，2附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510632)

卵巢癌是女性生殖器官常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其中卵巢上皮癌死亡率占各類婦科腫瘤的首位，其5年存活率僅為44%，對(duì)女性生命造成嚴(yán)重威脅[1]。手術(shù)聯(lián)合化療是卵巢惡性腫瘤的主要治療手段[2-4]。約60%～80%的晚期卵巢上皮癌的患者對(duì)順鉑(cisplatin, CIS)加紫杉醇聯(lián)合化療敏感，可達(dá)到完全臨床緩解，但是部分患者在化療過(guò)程中出現(xiàn)對(duì)順鉑敏感性降低而導(dǎo)致復(fù)發(fā)，此外約22.8%患者表現(xiàn)為原發(fā)性耐藥[5-7]。卵巢癌對(duì)化療藥物的耐受是其預(yù)后差的重要原因。因而，卵巢癌對(duì)順鉑耐藥的機(jī)制及如何逆轉(zhuǎn)耐藥仍是當(dāng)前卵巢癌基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。

ClC-3氯通道在多種腫瘤中表達(dá)及活性異常，從而影響著腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為[8-12]。化療藥物誘導(dǎo)的ClC-3上調(diào)激活NF-κB信號(hào)通路，導(dǎo)致NF-κB p65核易位，這就提高了多藥耐藥基因mdr1的轉(zhuǎn)錄活性，最終增加了其編碼的P-糖蛋白的表達(dá)，促進(jìn)了化療藥物的外排[13]。本課題組發(fā)現(xiàn)在卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞中ClC-3氯通道的表達(dá)增多、通道功能增強(qiáng)；而在乳腺癌他莫昔芬耐藥細(xì)胞中，ClC-3氯通道的表達(dá)減少、通道功能則降低(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。ClC-3氯通道在不同腫瘤和不同化療藥物耐藥細(xì)胞中如何改變，如何影響腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性依然存在諸多爭(zhēng)議。本項(xiàng)工作從 mRNA、蛋白和通道功能方面研究卵巢癌順鉑敏感細(xì)胞a2780和順鉑耐藥細(xì)胞a2780cp中ClC-3的差異，為深入探討ClC-3氯通道在卵巢癌細(xì)胞耐藥中的作用提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞株

人卵巢上皮癌細(xì)胞株a2780和a2780cp 由Benjamin K. Tsang教授贈(zèng)予 (Ottawa Hospital Research Institute)。

2 主要試劑

順鉑購(gòu)自Sigma，純度≥98%，用DMSO溶解成100 mmol/L的儲(chǔ)存液，避光保存于4 ℃；SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)購(gòu)自TaKaRa；抗ClC-3抗體購(gòu)自Abcam；山羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶IgG (H+L) 購(gòu)自Proteintech；抗GAPDH抗體購(gòu)自杭州賢至生物有限公司；5-nitro-2-(3-phenylpropylamino) benzoic acid(NPPB) 購(gòu)自Sigma，用DMSO溶解為100 mmol/L的儲(chǔ)存液。

3 主要方法

3.1MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，計(jì)算抑制率 將a2780和a2780cp細(xì)胞以每孔6 000個(gè)的數(shù)量分別種于96孔板中，培養(yǎng)4 h待細(xì)胞貼壁后，加入順鉑，濃度按照如下設(shè)置(μmol/L)：0、1、2、4、8、16、32、64和128。培養(yǎng)48 h后，各孔加入20 μL 5 μmol/L的MTT，37 ℃培養(yǎng)4 h。吸取培養(yǎng)液，各孔加入150 μL DMSO，振蕩培養(yǎng)板，于37 ℃孵育10 min，充分溶解結(jié)晶物。用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(A)值，以空白組調(diào)零，通過(guò)與對(duì)照組比較得到實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的存活率，抑制率(%)=(A對(duì)照組-A順鉑組)/A對(duì)照組×100%。

3.2Real-time PCR檢測(cè)ClC氯通道家族mRNA的表達(dá) 采用氯仿抽提RNA，上機(jī)檢測(cè)A值與濃度，再根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的要求配制試劑，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃ ∞。將逆轉(zhuǎn)錄好的cDNA根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒的要求配制體系，設(shè)置反應(yīng)條件如下：95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；獲得熔解曲線，最后根據(jù)得出的Ct值計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)中用到的引物序列見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR引物序列

3.3Western blot檢測(cè)細(xì)胞中ClC-3蛋白的表達(dá) 將a2780和a2780cp細(xì)胞用蛋白裂解液裂解之后，用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度計(jì)算20 μg蛋白的上樣量，用10%SDS-PAGE根據(jù)分子量大小分離蛋白，將目的蛋白進(jìn)行切膠并且轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，牛奶封閉后，加入ClC-3 Ⅰ抗孵育過(guò)夜，洗膜后再加入Ⅱ抗孵育2 h，最后進(jìn)行顯影以及條帶灰度值分析。

3.4免疫熒光觀察ClC-3氯通道的分布 將a2780和2780cp細(xì)胞接種在confocal皿上，a2780細(xì)胞長(zhǎng)得緩慢且抱團(tuán)生長(zhǎng)，故每個(gè)皿約種10×104個(gè)細(xì)胞，a2780cp細(xì)胞生長(zhǎng)較快，故每個(gè)皿約種8×104個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)1 d，待細(xì)胞單層長(zhǎng)到80%時(shí)進(jìn)行處理。經(jīng)過(guò)固定，通透和封閉等一系列處理，采用1∶50的比例用Ⅰ抗稀釋液稀釋抗體，孵育ClC-3抗體。根據(jù)Ⅰ抗的稀釋比例，采用1∶100的比例稀釋熒光Ⅱ抗對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色處理。

3.5全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞氯電流 降低胰酶濃度消化 a2780和a2780cp細(xì)胞，然后吹打?yàn)閱渭?xì)胞懸液，滴加在直徑 22 mm 的圓形玻片上，37 ℃孵育5 min，然后貼于灌流槽內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。EPC-7 膜片鉗放大器在全細(xì)胞電壓鉗制模式下記錄全細(xì)胞電流，在 0 mV、±40 mV和±80 mV的電壓下鉗制細(xì)胞，脈沖波寬 200 ms，間隔 4 s。用 CED 1401 采集電流和電壓信號(hào)，用 EPC 軟件(CED，Cambridge Electronic Design) 記錄并分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。等滲灌流2～5 min待基礎(chǔ)電流穩(wěn)定，加入5 μmol/L順鉑，待電流達(dá)到穩(wěn)定峰值，加入100 μmol/L NPPB 阻斷電流，計(jì)算抑制率，抑制率(%)=[(Cmax-Ciso)-(Cblocker-Ciso)]/(Cmax-Ciso)×100%，其中 Ciso是基礎(chǔ)電流值，Cmax是順鉑激活的電流最大值，Cblocker是加入阻斷劑后的穩(wěn)定電流值。

3.6細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染前1天接種細(xì)胞約每孔1.5×106個(gè)于6孔板中，細(xì)胞密度在轉(zhuǎn)染時(shí)為90%～95%覆蓋率較好。以下以1個(gè)孔轉(zhuǎn)染樣本為例，配轉(zhuǎn)染液。準(zhǔn)備2個(gè)EP管，分別各吸取120 μL Opti-MEM 于2個(gè)EP管中。使用前先輕輕彈勻Lipofectamine 2000。 取5μL 的ClC-3 siRNA加入Opti-MEM中，最好逐滴加入，用小槍頭靠近液面慢慢打出，輕輕吹打混勻，標(biāo)記為siRNA管。陰性對(duì)照(negative control, NC)管操作相同。將以上2管液體分別混勻，室溫放置20 min。將該混合液輕輕滴入到需要轉(zhuǎn)染的孔板中，輕輕搖板將其與培養(yǎng)基混勻。將細(xì)胞放入孵箱中培養(yǎng)，根據(jù)具體轉(zhuǎn)染要求考慮何時(shí)更換新的培養(yǎng)基，一般應(yīng)在6～10 h內(nèi)進(jìn)行換液。轉(zhuǎn)染48 h后，采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞ClC-3蛋白的表達(dá)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用(配對(duì))t檢驗(yàn)和方差分析方法檢驗(yàn)差異顯著性，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 a2780和a2780cp細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性存在差異

與未加順鉑細(xì)胞相比，順鉑作用于a2780，可以明顯看到細(xì)胞皺縮，細(xì)胞數(shù)目減少，隨著順鉑的作用濃度增加，細(xì)胞數(shù)量減少明顯，形態(tài)由原來(lái)的多棱形變成橢圓形或者圓形,見(jiàn)圖1A；MTT結(jié)果顯示，順鉑對(duì)a2780細(xì)胞增殖的抑制率也表現(xiàn)出濃度依賴性，其IC50值為5 μmol/L,而順鉑對(duì)a2780cp細(xì)胞增殖的抑制率并不明顯，其IC50值高達(dá)20 μmol/L，與a2780細(xì)胞相比顯著升高(P<0.01)，見(jiàn)圖1B。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定a2780和a2780cp對(duì)順鉑敏感性存在差異。

2 a2780和a2780cp細(xì)胞ClC家族mRNA的表達(dá)

Real-time PCR結(jié)果顯示,a2780細(xì)胞主要表達(dá)ClC-3 mRNA，此外少量表達(dá)ClC-2 mRNA，a2780cp細(xì)胞也主要表達(dá)ClC-3 mRNA以及少量表達(dá)ClC-2 mRNA。然而與a2780細(xì)胞相比，a2780cp細(xì)胞中ClC-3 mRNA表達(dá)降低(P<0.01)，而ClC-2的mRNA無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖2。

3 a2780和a2780cp細(xì)胞ClC-3蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與敏感株a2780細(xì)胞相比，耐藥株細(xì)胞a2780cp的ClC-3蛋白表達(dá)減少(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

4 a2780和a2780cp細(xì)胞ClC-3蛋白的細(xì)胞分布

免疫熒光結(jié)果顯示，卵巢癌a2780和a2780cp細(xì)胞的ClC-3在細(xì)胞膜、胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)均有分布，但在a2780細(xì)胞主要分布在其細(xì)胞膜和核上，而在a2780cp細(xì)胞中則主要分布在其細(xì)胞核，見(jiàn)圖4。

5 膜片鉗技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞氯通道功能差異

Figure 1.Effects of cisplatin on proliferation of ovarian cancer sensitive cells a2780 and ovarian cancer resistant cells a2780cp. A: optical images of a2780 and a2780cp cells after treating with different concentration cisplatin for 48 h, respectively (×200); B: results of MTT assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsa2780cp group.

圖1 卵巢癌a2780 和a2780cp細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的差異

Figure 2.The expression and difference of ClC families in ovarian cancer sensitive cells a2780 and ovarian cancer resistant cells a2780cp by real-time PCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsa2780 group.

圖2 Real-time PCR法定量分析ClC家族在a2780和a2780cp細(xì)胞中表達(dá)差異

Figure 3.Difference of ClC-3 expression between a2780 and a2780cp cells. Mean±SD.n=4.**P<0.01vsa2780 group.

圖3 Western blot測(cè)細(xì)胞之間ClC-3蛋白表達(dá)量的差異

Figure 4.Distribution of ClC-3 in membrane, organelle and nucleus of sensitive and drug-resistant ovarian cancer cells by immunofluorescence assay. ClC-3 protein is labeled by green fluorescent. The scale bar=10 μm.

圖4 免疫熒光法觀察卵巢癌a2780和a2780cp細(xì)胞的ClC-3在膜、細(xì)胞器和核的分布情況

Figure 5.Cisplatin activated Cl-currents in a2780 cells, but can not activated in a2780cp cells. Mean±SD.n=5,**P<0.01vsa2780 group.

圖5 膜片鉗技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞氯通道功能差異

而a2780cp細(xì)胞在等滲灌流情況下，±80mV電壓鉗制下背景電流分別為(5.32±1.37)pA/pF和(-5.68±2.03)pA/pF；5 μmol/L順鉑溶液灌流40 min后，電流密度沒(méi)有增大，但是低滲(Hypo)刺激使電流分別增加到(55.67±4.65)pA/pF和(-45.34±3.78)pA/pF，表明a2780cp細(xì)胞的氯通道只是對(duì)5 μmol/L的順鉑無(wú)反應(yīng)，見(jiàn)圖5。

6 膜片鉗技術(shù)確定ClC-3氯通道在兩者功能差異中起主要作用

Western blot檢測(cè)確定a2780細(xì)胞的ClC-3蛋白表達(dá)被成功下調(diào)(P<0.01)，見(jiàn)圖6A。從結(jié)果可以看出，在±80 mV的電壓鉗制下，順鉑仍然能夠激活NC siRNA處理的a2780細(xì)胞，電流分別為(56.52±4.36) pA/pF 及(-43.16±3.02) pA/pF；然而，ClC-3 siRNA沉默a2780細(xì)胞的ClC-3表達(dá)后，順鉑則無(wú)法激活其氯通道，見(jiàn)圖6。

討 論

卵巢癌是婦科死亡率最高的惡性腫瘤。以鉑類為基礎(chǔ)的化療耐藥是卵巢癌預(yù)后差的重要原因，基礎(chǔ)與臨床研究在這方面也做了大量的工作，如：(1)藥物的進(jìn)入和排出可能是藥物敏感性降低的重要因素之一;(2)也有報(bào)道說(shuō)胞內(nèi)蛋白的失活是導(dǎo)致順鉑耐藥的原因;(3)DNA的修復(fù)狀態(tài)也有可能影響耐藥[11-12]。然而卵巢癌順鉑耐藥機(jī)制復(fù)雜，迄今人們對(duì)卵巢癌順鉑耐藥的機(jī)制并未完全了解。

氯通道在多種腫瘤中表達(dá)異常，在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲，轉(zhuǎn)移及耐藥等惡性生物學(xué)行為中起著重要作用[13-16]。我們?cè)趯?duì) ClC-3 氯通道的研究中觀察到，低分化鼻咽癌細(xì)胞 ClC-3 蛋白表達(dá)增高，其通道功能對(duì)抗腫瘤藥物反應(yīng)更敏感；具有抗腫瘤活性的中藥單體大黃素、雙氫青蒿素，及最新引起研究者關(guān)注的傳統(tǒng)抗酗酒藥——雙硫侖螯合銅等均可快速在3～10 min內(nèi)激活氯電流、增加 ClC-3 氯通道蛋白的表達(dá)； siRNA 干擾ClC-3 蛋白表達(dá)則抑制這些藥物誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡[17-20]。然而，在卵巢癌中ClC-3參與抗腫瘤藥物的作用機(jī)制及其在抗腫瘤藥物耐藥中的作用國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究觀察到敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞在ClC家族的主要表達(dá)ClC-3，并且耐藥細(xì)胞的ClC-3表達(dá)減少，緊接著我們還檢測(cè)到敏感細(xì)胞ClC-3主要分布在細(xì)胞膜上，而耐藥細(xì)胞主要分布在胞質(zhì)和胞核中。然而在Chen等[21]的研究中，肺癌紫杉醇耐藥細(xì)胞A549T的ClC-3表達(dá)高于敏感細(xì)胞，這提示ClC-3的差異性表達(dá)和分布可能是細(xì)胞對(duì)順鉑以及其它藥物敏感性存在差異的原因，并且ClC-3可能在不同藥物的耐藥細(xì)胞中扮演了不同的角色。為了進(jìn)一步證明這個(gè)問(wèn)題，我們用順鉑作用于2種細(xì)胞，觀察順鉑對(duì)2種細(xì)胞氯通道的影響。有文獻(xiàn)報(bào)道順鉑能夠通過(guò)嘌呤受體途徑激活鼻咽癌細(xì)胞的ClC-3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。在本研究中也觀察到順鉑能夠激活順鉑敏感細(xì)胞的氯通道，而下調(diào)敏感細(xì)胞ClC-3蛋白的表達(dá)，則無(wú)法再被順鉑激活，確定順鉑激活的為ClC-3介導(dǎo)的氯電流。同時(shí)相同濃度的順鉑是無(wú)法激活耐藥細(xì)胞的。說(shuō)明2種細(xì)胞之間的ClC-3氯通道功能存在差異。有報(bào)道分析，在ClC-3高表達(dá)的細(xì)胞中，化療藥物誘導(dǎo)ClC-3的上調(diào)，激活 NF-κB 信號(hào)通路并導(dǎo)致 NF-κB的 P65 核轉(zhuǎn)位，從而增強(qiáng)多藥耐藥基因mdr1的轉(zhuǎn)錄活性，最終增加 P-糖蛋白表達(dá)并促進(jìn)化療藥物的外排[13]。而順鉑耐藥細(xì)胞ClC-3低表達(dá)，那么此時(shí)ClC-3的作用并非促進(jìn)藥物外排，可能是阻止藥物進(jìn)入細(xì)胞，從而引起耐藥。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，順鉑作用于耐藥細(xì)胞，誘導(dǎo)ClC-3蛋白表達(dá)的減少以及細(xì)胞膜上ClC-3的構(gòu)象改變，導(dǎo)致藥物與ClC-3的作用靶點(diǎn)發(fā)生改變，最后順鉑無(wú)法激活細(xì)胞的ClC-3氯通道，從而被阻滯于細(xì)胞外。通過(guò)本文的分析，ClC-3可能是卵巢癌順鉑耐藥的重要因素。這為我們進(jìn)一步研究ClC-3在卵巢癌順鉑耐藥中所起到的作用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

Figure 6.Cisplatin activated Cl-currents in a2780-NC siRNA cells, but cannot activated in a2780-ClC-3 siRNA cells. A: we successfully down-regulated the expression of a2780 ClC-3 protein in a2780 cells; B: cisplatin could induce Cl-current in a2780-NC siRNA cells as shown with a typical time course, but could not in a2780-ClC-3 siRNA cells. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsa2780-NC siRNA group.

圖6 膜片鉗技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞氯通道功能差異