習(xí)大林，項(xiàng) 靜，蔡軍偉，趙舒祺，吉晶晶，李 月，蘇 婷，姜 勇，劉靖華

(南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東省蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510515)

細(xì)菌脂蛋白(bacterial lipoprotein，BLP)是廣泛存在于革蘭氏陰性和陽(yáng)性細(xì)菌外膜的脂蛋白，可由生長(zhǎng)或裂解的細(xì)菌釋放。既往研究發(fā)現(xiàn)，給予動(dòng)物小劑量BLP后，再給予大劑量或者致死劑量的BLP時(shí)，能大大降低動(dòng)物的死亡率，這種現(xiàn)象被稱(chēng)為BLP耐受[1]。研究發(fā)現(xiàn)，BLP耐受不僅能減少致死劑量的BLP引起的動(dòng)物死亡，而且能防御大劑量的細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)引起的內(nèi)毒素休克，即所謂的交叉耐受。更重要的是，BLP耐受還能降低動(dòng)物感染細(xì)菌或者盲腸結(jié)扎穿刺所引起的死亡率[1]。BLP耐受是生物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的一種保護(hù)性調(diào)節(jié)機(jī)制，目的是避免機(jī)體對(duì)BLP或者內(nèi)毒素再次刺激過(guò)度反應(yīng)而造成損傷，是機(jī)體防御機(jī)制的重要組成部分。因此，探討B(tài)LP耐受保護(hù)作用的機(jī)制不僅有助于了解機(jī)體在抗感染過(guò)程中的適應(yīng)性應(yīng)答機(jī)制，加深我們對(duì)膿毒性休克發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)，而且還有可能為膿毒性休克的防治提供新的思路。

目前，有關(guān)BLP耐受的機(jī)制尚不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)，在機(jī)體(細(xì)胞)對(duì)BLP的耐受過(guò)程中，其突出表現(xiàn)之一為BLP耐受機(jī)體(細(xì)胞)對(duì)病原菌的吞噬和清除能力顯著增強(qiáng)[2]。吞噬細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞)對(duì)細(xì)菌的清除包括吞噬體形成、吞噬溶酶體內(nèi)的酶對(duì)細(xì)菌的殺滅和消化等一系列過(guò)程，其中吞噬相關(guān)受體介導(dǎo)的對(duì)病原微生物的吞噬是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。細(xì)胞表面吞噬相關(guān)受體主要包括調(diào)理素依賴(lài)性受體(如Fc受體和補(bǔ)體受體)以及調(diào)理素非依賴(lài)受體(如清道夫家族受體)[3-4]。Fc受體和補(bǔ)體受體在BLP耐受巨噬細(xì)胞中吞噬作用增強(qiáng)已得到證明[1]，但是膠原樣結(jié)構(gòu)巨噬細(xì)胞受體(macrophage receptor with collagenous structure，MARCO)是否也參與了BLP耐受的過(guò)程尚不清楚。本研究利用骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞(bone marrow derive macrophages，BMDMs)為細(xì)胞模型，探討了MARCO在BLP耐受巨噬細(xì)胞吞噬能力增強(qiáng)過(guò)程中的作用。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

TRIzol總RNA提取試劑和LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Thermo Fisher；熒光定量PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(FSQ-101)及SYBR Green(QPK-201)購(gòu)自TOYOBO；熒光定量PCR引物由華大基因設(shè)計(jì)合成；小干擾RNA由吉瑪基因公司(中國(guó))合成； 小鼠MARCO-APC抗體購(gòu)自R&D；MARCO(IBL-12)和抗β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和OPTI-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco。

2 動(dòng)物、細(xì)胞與細(xì)菌

SPF級(jí)C57BL/6小鼠，8～10周齡，18～20 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK(粵)2016-0041。大腸桿菌(E.coli，K12)菌株和轉(zhuǎn)染了 pET-14b-GFP質(zhì)粒的大腸桿菌(GFP-E.coli)由本室保存。L929細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞研究所(上海)。

3 主要方法

3.1BMDMs的分化及培養(yǎng) BMDMs的分化及培養(yǎng)參考文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行。將L929細(xì)胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)5～7 d，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，用0.22 μm濾器過(guò)濾后與含有20% FBS的DMEM按體積比1 ∶4比例混勻，配制成BMDMs完全培養(yǎng)基，備用。取C57BL/6小鼠處死，暴露并分離股骨和脛骨，用DMEM沖洗骨髓腔，300×g離心10 min后收集骨髓沉淀；用完全培養(yǎng)基充分吹打骨髓沉淀使其分散成單細(xì)胞懸液，平鋪至培養(yǎng)瓶中，放于37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，獲得分化成熟的BMDMs。取1×105個(gè)BMDMs加入巨噬細(xì)胞分子標(biāo)志F4/80抗體(1 ∶10)并在室溫下標(biāo)記30 min，再與FITC熒光標(biāo)記Ⅱ抗避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)F4/80抗體標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞比例大于96%。

3.2BLP耐受BMDMs的制備 取成熟的BMDMs細(xì)胞，給予0.1 μg/L的BLP處理24 h，該部分細(xì)胞為 BLP耐受的 BMDMs；未經(jīng) BLP預(yù)處理的即為非耐受BMDMs(naive BMDMs)。

3.3吞菌實(shí)驗(yàn) 取naive或BLP耐受BMDMs，按細(xì)胞與細(xì)菌1 ∶ 50的比例加入GFP標(biāo)記的大腸桿菌，感染30 min后，DPBS洗3次，洗去細(xì)胞外細(xì)菌，收集細(xì)胞用熒光顯微鏡直接觀察并拍照，或者用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞吞菌情況。

3.4qPCR TRIzol法提取總RNA后，逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA，分別加入MARCO及β-actin引物進(jìn)行擴(kuò)增，使用熒光定量PCR儀記錄擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，通過(guò)2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。目的基因的引物序列見(jiàn)表1。

表1 qPCR引物序列

3.5流式細(xì)胞術(shù) BMDMs感染細(xì)菌30 min后，用0.25 %胰酶消化細(xì)胞，800×g離心5 min收集細(xì)胞。加入MARCO-APC熒光抗體，避光孵育15 min后，離心棄上清，DPBS重懸，用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。GFP的激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為507 nm;APC熒光的激發(fā)波長(zhǎng)為630 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為660 nm。

3.6MARCO小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)參照Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取1×106BMDMs與2 μg 靶向MARCO的siRNA(siMARCO)或?qū)φ誖NA(scramble siRNA,Scr RNA)混合，加入6 μL lipofectamine 3000，干擾24 h后用熒光定量PCR檢測(cè)干擾效率。siMARCO的序列如下:sense: 5’-GCAUGGCAUGCAUGGC-CAUTT-3’，antisense: 5’-CTTCTTGGGCACTGGAT-CAT-3’；ScrRNA: sence: 5’-GCGAGCACAGCTTCTTT-GC-3’，antisense: 5’-GCGCAGCGATATCGTCATC-3’。MARCO的干擾效率分別用qPCR(mRNA表達(dá)水平)及流式細(xì)胞術(shù)(蛋白表達(dá)水平)檢測(cè)，具體方法同前。

3.7細(xì)胞免疫熒光 BMDM與細(xì)菌共孵育30 min后，用DPBS洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，之后用0.1 % Triton X-100處理10 min，并用封閉液封閉1 h；然后加入MARCO抗體室溫孵育2 h；用PBS 洗3遍后，用IF555標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG(1 ∶500)在室溫下進(jìn)行染色，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，最后在共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。GFP的激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為507 nm；IF555 熒光激發(fā)波長(zhǎng)為550 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為570 nm。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，在滿(mǎn)足方差齊性的條件下，2組間比較使用非配對(duì)t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 BLP 耐受 BMDMs 吞噬細(xì)菌的能力較naive細(xì)胞明顯增強(qiáng)

圖1A是實(shí)驗(yàn)流程及干預(yù)示意圖，BLP耐受(BLP-tolerized)組給予BMDMs細(xì)胞0.1 μg/L BLP預(yù)處理24 h，再給予GFP標(biāo)記的大腸桿菌感染；naive組的BMDMs未經(jīng)BLP預(yù)處理。無(wú)論是BLP 耐受組BMDMs還是naive 細(xì)胞，給予細(xì)菌感染30 min后，共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞胞漿內(nèi)均有綠色熒光，且BLP 耐受組BMDMs的綠色熒光明顯多于naive 組細(xì)胞,見(jiàn)圖1B；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞吞菌結(jié)果顯示，BLP耐受組較naive組峰值右移，中位熒光強(qiáng)度(median fluorescence intensity，MFI)明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1C，提示與naive組相比，BLP耐受組BMDMs吞噬細(xì)菌能力明顯增強(qiáng)。

Figure 1.The effect of BLP tolerance on phagocytosis of macrophage. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnaive BMDMs.

圖1 BLP耐受對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

2 BLP耐受上調(diào)巨噬細(xì)胞MARCO的表達(dá)

qPCR結(jié)果顯示，在靜息狀態(tài)時(shí)naive組BMDMs中MARCO的mRNA轉(zhuǎn)錄水平很低，3次定量PCR的Ct值均值為29.37； BLP耐受組BMDMs的MARCO mRNA轉(zhuǎn)錄增加，在加入BLP 24 h時(shí)是naive細(xì)胞的890倍；與naive組相比，BLP耐受巨噬細(xì)胞MARCO的mRNA水平顯著升高(P<0.05)； 給予大腸桿菌刺激30 min后，2組巨噬細(xì)胞中MARCO mRNA的表達(dá)均較未刺激時(shí)進(jìn)一步升高，BLP耐受組仍顯著高于naive組(P<0.05)，見(jiàn)圖2A。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，BLP耐受能顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞膜表面MARCO的蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，且在大腸桿菌刺激后仍維持高表達(dá)并顯著高于naive組(P<0.05)，見(jiàn)圖2B。提示BLP耐受在mRNA和蛋白表達(dá)水平均能明顯上調(diào)MARCO分子的表達(dá)。

3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)下調(diào)MARCO的表達(dá)對(duì) BLP耐受巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

qPCR檢測(cè)顯示，siMARCO組BMDMs的 mRNA干擾效率超過(guò)70%(P<0.05),見(jiàn)圖3A；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，siMARCO組BMDMs的MARCO蛋白表達(dá)水平較scrRNA組明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3B，提示RNAi效果理想。流式結(jié)果進(jìn)一步顯示，干擾MARCO表達(dá)后，無(wú)論是naive還是BLP耐受組BMDMs吞噬細(xì)菌的量都有減少，其中對(duì)BLP耐受組的吞菌影響比較顯著(P<0.05)，見(jiàn)圖3C。

Figure 2.The effect of BLP tolerance on MARCO expression in the BMDMs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnaive BMDMs.

圖2 BLP耐受對(duì)巨噬細(xì)胞MARCO表達(dá)的影響

4 熒光顯微鏡觀察下調(diào)MARCO的表達(dá)對(duì) BLP耐受巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，靜息狀態(tài)的naive細(xì)胞胞漿中有微弱的紅色熒光，表明MARCO的表達(dá)量很低；細(xì)菌刺激30 min后代表MARCO的紅色熒光增強(qiáng)不明顯；BLP耐受BMDMs在未受細(xì)菌刺激時(shí)，胞漿及胞膜位置有較強(qiáng)的紅色熒光，表明MARCO在BLP耐受BMDMs的表達(dá)較naive顯著增強(qiáng)；細(xì)菌刺激后BLP耐受BMDMs的紅色熒光仍然較naive組明顯增強(qiáng)。干擾MARCO表達(dá)后，無(wú)論是naive還是BLP耐受BMDMs細(xì)胞的綠色熒光均明顯減弱，以BLP耐受細(xì)胞綠色熒光降低較為顯著，見(jiàn)圖4，提示下調(diào)MARCO表達(dá)減弱BLP耐受細(xì)胞的吞菌能力。

討 論

清道夫受體是一類(lèi)表達(dá)于巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白分子[6]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，清道夫受體除了吞噬脂蛋白參與脂質(zhì)調(diào)節(jié)外，還作為一種模式識(shí)別受體，通過(guò)識(shí)別多種微生物結(jié)構(gòu)，即病原相關(guān)分子模式，包括LPS、磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)及細(xì)菌CpG DNA等，在固有免疫中發(fā)揮重要作用[7-9]。目前已鑒定的清道夫受體有8類(lèi)，分別用A類(lèi)～I(xiàn)類(lèi)表示(C類(lèi)除外)。MARCO也被稱(chēng)作SCARA2或SR-A2，是A類(lèi)清道夫受體的一種，在巨噬細(xì)胞的吞噬中發(fā)揮重要作用。與該家族大多數(shù)成員不同，MARCO在靜息狀態(tài)下僅表達(dá)于脾臟和淋巴結(jié)等組織的巨噬細(xì)胞，但多種病原體可通過(guò)TLR信號(hào)通路迅速上調(diào)MARCO水平，誘導(dǎo)大多數(shù)組織巨噬細(xì)胞MARCO表達(dá)增加，例如肝臟枯否細(xì)胞等[10-12]。我們發(fā)現(xiàn)，靜息狀態(tài)的BMDMs中MARCO的mRNA水平很低；當(dāng)受到BLP刺激后，MARCO的mRNA水平增加，在BLP刺激24 h時(shí)是naive細(xì)胞的890倍；與此同時(shí)細(xì)胞膜表面的MARCO表達(dá)也明顯增加，與以往的報(bào)道一致。關(guān)于BLP上調(diào)MARCO的具體機(jī)制目前尚不清楚。以往的研究表明，在感染狀態(tài)下，MARCO的上調(diào)主要是通過(guò)MyD88信號(hào)通路介導(dǎo)的[13]；在樹(shù)突狀細(xì)胞中，這個(gè)過(guò)程還可能與p38絲裂原激活的蛋白激酶相關(guān)[14]。研究發(fā)現(xiàn)LPS或LTA耐受的巨噬細(xì)胞中MARCO的上調(diào)依賴(lài)于組蛋白第四位賴(lài)氨酸的三甲基化修飾，即H3K4me3參與了固有免疫耐受中MARCO蛋白增加的調(diào)控過(guò)程[15]。此外，研究發(fā)現(xiàn)瘧原蟲(chóng)感染可通過(guò)TLR2信號(hào)通路，增加H3K4me3，出現(xiàn)類(lèi)似于固有免疫耐受的表現(xiàn)[16]。BLP作為一種病原體相關(guān)分子模式，主要通過(guò)TLR2啟動(dòng)內(nèi)源性免疫應(yīng)答，因而推測(cè)BLP耐受上調(diào)MARCO可能是與TLR2信號(hào)通路活化、組蛋白修飾增加相關(guān)。

Figure 3.The effect of silencing MARCO on phagocytosis of BLP tolerized BMDMs.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsscrRNA group.

圖3 干擾MARCO表達(dá)對(duì) BLP耐受巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

Figure 4.The effect of MARCO doion-regulation on the phagocytosis of BMDMs exhibited by fluorescence microscopy. Red: MARCO; green: GFP-E.coli; blue: DAPI.

圖4 熒光顯微鏡檢測(cè)下調(diào)MARCO表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞吞菌能力的影響

以往的研究表明，MARCO參與了機(jī)體對(duì)抗細(xì)菌感染的過(guò)程。例如，MARCO基因敲除小鼠較野生型小鼠對(duì)肺炎鏈球菌感染抵抗力明顯下降[17]；在斑馬魚(yú)的研究中發(fā)現(xiàn)，MARCO可顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的內(nèi)吞和清除[18]；本研究用原代的巨噬細(xì)胞BMDMs證明，MARCO與巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌的能力有關(guān)，因?yàn)锽LP耐受時(shí)MARCO表達(dá)水平上調(diào)，同時(shí)對(duì)大腸桿菌的吞噬能力增強(qiáng)，而敲減MARCO表達(dá)后，這種增強(qiáng)的吞噬作用減弱，提示BLP耐受增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力依賴(lài)于MARCO的表達(dá)水平。MARCO表達(dá)后如何促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬，其機(jī)制尚不完全清楚。

吞噬作用涉及復(fù)雜的過(guò)程，包括細(xì)菌的識(shí)別和黏著、吞噬杯形成和吞噬體的閉合，這些都涉及細(xì)胞骨架的重構(gòu)。有研究發(fā)現(xiàn)，肺泡巨噬細(xì)胞通過(guò)其表面的MARCO識(shí)別并結(jié)合細(xì)菌，啟動(dòng)細(xì)胞骨架重構(gòu)，進(jìn)而上調(diào)細(xì)胞表面MARCO蛋白的表達(dá)和細(xì)菌吞噬能力[19]。進(jìn)一步研究證實(shí)Rac1-GTP參與調(diào)控了MARCO的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并激活肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2/3復(fù)合體，從而誘導(dǎo)一系列吞噬細(xì)菌所必需的行為，包括纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)的聚合、絲狀偽足的形成以及細(xì)胞表面MARCO蛋白表達(dá)的增加[19]。然而，從老年鼠體內(nèi)分離出的肺泡巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出Rac1 mRNA和蛋白低表達(dá)，導(dǎo)致Rac1-GTP水平、肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2/3復(fù)合體水平的降低以及隨之而來(lái)的纖維狀肌動(dòng)蛋白的聚合、絲狀偽足的形成以及細(xì)胞表面MARCO蛋白表達(dá)減弱，老年肺泡巨噬細(xì)胞的細(xì)菌吞噬能力也因此下降。值得注意的是，該研究認(rèn)為MARCO在巨噬細(xì)胞表達(dá)與F-actin聚合誘導(dǎo)的細(xì)胞骨架重排有關(guān)，后者促進(jìn)MARCO的表達(dá)，反過(guò)來(lái)增強(qiáng)肺巨噬細(xì)胞吞噬大腸桿菌的能力；而在我們的研究中，BLP預(yù)處理24 h就能大大增加BMDMs細(xì)胞表面MARCO的表達(dá)，細(xì)菌刺激后MARCO進(jìn)一步增加并不明顯；MARCO蛋白表達(dá)變化與其mRNA轉(zhuǎn)錄變化一致，提示BLP耐受巨噬細(xì)胞MARCO在細(xì)胞表面的表達(dá)可能與轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)有關(guān)。但是細(xì)菌感染后MARCO在細(xì)胞膜表面的表達(dá)是否與F-actin聚合及絲狀偽足的形成有關(guān)，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。