趙思怡， 陳 菲， 張鶴山2， 張志飛

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 長(zhǎng)沙 410128； 2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所， 武漢 430064)

紅三葉(TrifoliumpretenseL.)是豆科(Leguminosae)三葉草屬多年生草本植物，原產(chǎn)于小亞西亞及歐洲西南部，在我國(guó)大部分省份有栽培[1]。紅三葉側(cè)根發(fā)達(dá)，且根瘤多，耐陰性較強(qiáng)，可用于果樹全園內(nèi)或行間種植[2]，具有維持果園生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性、培肥地力、減輕病蟲雜草危害等作用。而常期噴施含銅殺菌劑或施用規(guī)模畜禽養(yǎng)殖糞便的老果園土壤中銅污染嚴(yán)重[3]。銅是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素，也是重金屬污染元素，銅可維持植物正常生理代謝過程，但過量的銅會(huì)造成植物水分代謝、光合作用、呼吸作用等各種生理代謝紊亂[4]，抑制植物生長(zhǎng)，甚至造成植物死亡。不同植物對(duì)銅脅迫的耐受性差異較大，選育高耐銅品種是解決銅污染問題較為經(jīng)濟(jì)便捷的措施。本研究以51份紅三葉種質(zhì)資源為研究對(duì)象，利用中等脅迫強(qiáng)度的Cu2+進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)，比較Cu2+脅迫與對(duì)照的發(fā)芽指標(biāo)和根系指標(biāo)差異，對(duì)發(fā)芽指標(biāo)和根系指標(biāo)相對(duì)值進(jìn)行相關(guān)性分析與主成分分析篩選耐銅性評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用加權(quán)隸屬函數(shù)法和聚類分析對(duì)51份紅三葉種質(zhì)資源進(jìn)行耐銅性綜合排序與分類，旨在研究萌發(fā)期紅三葉對(duì)高銅濃度的脅迫反應(yīng)，為紅三葉耐銅性品種選育與推廣提供依據(jù)。

表1 51份紅三葉種質(zhì)資源基本信息

編號(hào)材料名稱編號(hào)材料名稱編號(hào)材料名稱編號(hào)材料名稱H1CF002082H14CF022175H27CF022190H40CF022224H2CF005803H15CF022176H28CF022197H41CF022227H3CF022150H16CF022177H29CF022199H42CF022228H4CF022153H17CF022178H30CF022201H43CF022229H5CF022156H18CF022179H31CF022202H44CF022231H6CF022163H19CF022180H32CF022204H45CF022232H7CF022165H20CF022181H33CF022207H46CF022234H8CF022167H21CF022183H34CF022211H47CF022235H9CF022168H22CF022185H35CF022212H48CF022236H10CF022170H23CF022186H36CF022217H49CF022321H11CF022171H24CF022187H37CF022219H50CF022324H12CF022172H25CF022151H38CF022222H51CF022325H13CF022174H26CF022189H39CF022223

1 材料與方法

1.1 材 料

51份紅三葉種質(zhì)資源均由湖北省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所提供(表1)，為來源于俄羅斯的野生種質(zhì)資源。

1.2 試驗(yàn)方法

選取均勻一致、無病蟲害的種子，以50%的多菌靈可濕性粉劑(山東華陽農(nóng)藥化工集團(tuán)有限公司生產(chǎn))500倍液浸泡種子20 min，用蒸餾水沖洗2～3遍待用。

參照國(guó)家牧草種子檢驗(yàn)規(guī)程——發(fā)芽試驗(yàn)(GB/T 2930.4-2001)，以前期實(shí)驗(yàn)篩選的中等脅迫強(qiáng)度的Cu2+(CuSO4·5 H2O為銅源，100 mg·L-1)對(duì)51份紅三葉種質(zhì)資源進(jìn)行銅脅迫發(fā)芽試驗(yàn)，以去離子水為對(duì)照，每重復(fù)50粒種子，4次重復(fù)。人工氣候箱培養(yǎng)條件為20 ℃恒溫，16 h光照/8 h黑暗培養(yǎng)。每隔24 h統(tǒng)計(jì)1次種子發(fā)芽數(shù)，逐日觀察記載發(fā)芽種子數(shù)，以胚根或胚芽突破種皮長(zhǎng)于種子長(zhǎng)度為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，第10天結(jié)束試驗(yàn)。分別統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)[5]。

第10天結(jié)束試驗(yàn)時(shí)，每處理隨機(jī)選取10株幼苗，清水洗凈，以LA-S系列植物根系分析系統(tǒng)軟件(杭州萬深檢測(cè)科技有限公司)進(jìn)行根系掃描分析，統(tǒng)計(jì)總根長(zhǎng)(mm)、根系體積(mm3)、根系表面積(mm2)、根系平均直徑(mm)、根尖數(shù)(個(gè))等。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

指標(biāo)相對(duì)值(%)=(指標(biāo)脅迫處理值/指標(biāo)對(duì)照處理值)×100%。

運(yùn)用SPSS 22分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。根據(jù)9個(gè)萌發(fā)指標(biāo)和根系指標(biāo)相對(duì)值的相關(guān)性分析和因子主成分分析結(jié)果，篩選耐銅性評(píng)價(jià)指標(biāo)；以變異系數(shù)賦予權(quán)重，用加權(quán)隸屬函數(shù)法計(jì)算綜合隸屬函數(shù)值，對(duì)51份紅三葉種質(zhì)資源進(jìn)行耐銅性排序；用系統(tǒng)聚類法進(jìn)行聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu2+脅迫對(duì)紅三葉種子萌發(fā)與根系生長(zhǎng)的影響

銅脅迫處理的51份紅三葉種質(zhì)材料的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、總根長(zhǎng)等5項(xiàng)指標(biāo)顯著低于空白對(duì)照(p<0.05)；根系體積、根系平均直徑顯著高于空白對(duì)照(p<0.05)；根系表面積、根尖數(shù)與對(duì)照無顯著差異。說明100 mg·L-1Cu2+脅迫對(duì)紅三葉的萌發(fā)指標(biāo)有顯著抑制作用，但促進(jìn)根系體積、根系平均直徑的發(fā)育。51份紅三葉種質(zhì)材料在銅脅迫下，發(fā)芽指標(biāo)變異系數(shù)波動(dòng)范圍(64.7%～70.9%)大于對(duì)照發(fā)芽指標(biāo)的波動(dòng)范圍(20.7%～37.2%)；根系指標(biāo)的變異系數(shù)相對(duì)較小。表明在100 mg·L-1Cu2+脅迫下紅三葉發(fā)芽指標(biāo)的品種間差異大于根系間差異。

表2 51份紅三葉種質(zhì)資源不同處理下觀測(cè)指標(biāo)值的比較

觀測(cè)指標(biāo) 銅脅迫組 對(duì)照組 均值標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)/%最大值最小值均值標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)/%最大值最小值發(fā)芽勢(shì)/%34.0b24.170.983.51.553.7a12.723.686.521.0發(fā)芽率/%37.3b24.164.783.51.560.5a12.520.791.529.5發(fā)芽指數(shù)30.6b21.770.778.72.950.2a15.330.580.516.8活力指數(shù)99.4b67.067.4285.612.9248.2a92.437.2459.868.9總根長(zhǎng)/mm3.5b0.721.25.02.34.9a0.714.66.43.5根系表面積/mm27.2a1.723.610.94.47.2a1.621.710.95.0根系體積/mm31.2a0.428.22.10.70.9b0.333.01.70.5根系平均直徑/mm0.7a0.06.10.70.60.5b0.112.50.70.3根尖數(shù)/個(gè)1.1a0.214.01.51.01.2a0.213.61.71.0

注：同一行的不同小寫字母表示水平差異顯著(p<0.05)。

表3 各指標(biāo)相對(duì)值相關(guān)性分析

觀測(cè)指標(biāo) 相對(duì)發(fā)芽勢(shì)相對(duì)發(fā)芽率相對(duì)發(fā)芽指數(shù)相對(duì)活力指數(shù)相對(duì)總根長(zhǎng)相對(duì)根系表面積相對(duì)根系體積相對(duì)根系平均直徑相對(duì)發(fā)芽率0.951??相對(duì)發(fā)芽指數(shù)0.961??0.950??相對(duì)活力指數(shù)0.879??0.870??0.921??相對(duì)總根長(zhǎng)-0.384?-0.431-0.376??-0.059相對(duì)根系表面積-0.514??-0.571??-0.501??-0.2410.926??相對(duì)根系體積-0.541??-0.603??-0.527??-0.318?0.805??0.964??相對(duì)根系平均直徑-0.513??-0.565??-0.509??-0.477??0.294?0.611??0.766??相對(duì)根尖數(shù)-0.148-0.107-0.156-0.0150.453??0.434??0.401??0.121

2.2 指標(biāo)相對(duì)值的相關(guān)性分析

51份紅三葉種質(zhì)資源發(fā)芽、根系等9項(xiàng)指標(biāo)在銅脅迫和空白對(duì)照的相對(duì)值進(jìn)行兩兩相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：相對(duì)發(fā)芽勢(shì)除與相對(duì)根尖數(shù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性外，與其他7項(xiàng)指標(biāo)均有極限著或顯著相關(guān)性關(guān)系(p<0.01或p<0.05)；相對(duì)根系體積、相對(duì)根系平均直徑與4項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)相對(duì)值間均存在兩兩極限著負(fù)相關(guān)(p<0.01)，與其他3項(xiàng)根系指標(biāo)相對(duì)值間存在極限著正相關(guān)(p<0.01)?？傮w來看各指標(biāo)的相對(duì)值間相互關(guān)聯(lián)程度較高。

2.3 耐銅性評(píng)價(jià)指標(biāo)的篩選

對(duì)51份紅三葉種質(zhì)資源發(fā)芽、根系等9項(xiàng)指標(biāo)在銅脅迫和空白對(duì)照的相對(duì)值進(jìn)行因子主成分分析(表4、表5)。結(jié)果表明，前2個(gè)成分的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到82.589%，且特征值都大于1，第一主成分特征值為5.411，貢獻(xiàn)率為60.126%，對(duì)應(yīng)特征向量中載荷較大的3個(gè)指標(biāo)是相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)和相對(duì)發(fā)芽指數(shù)。第二主成分特征值為2.022，貢獻(xiàn)率為22.463%，對(duì)應(yīng)特征向量中載荷較大的2個(gè)指標(biāo)為相對(duì)活力指數(shù)和相對(duì)總根長(zhǎng)。根據(jù)指標(biāo)相關(guān)性分析和因子主成分分析結(jié)果，選擇在第一主成分或第二主成分中特征值較大，且具有代表性的指標(biāo)作為紅三葉耐銅綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別為：相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)活力指數(shù)和相對(duì)總根長(zhǎng)。

表4 3個(gè)主成分的特征值以及貢獻(xiàn)率

主成分特征值貢獻(xiàn)率/%累積貢獻(xiàn)率/%Ⅰ5.41160.12660.126Ⅱ2.02222.46382.589

表5 各因子載荷矩陣

觀測(cè)指標(biāo) 主成分ⅠⅡ相對(duì)發(fā)芽勢(shì)0.8890.378相對(duì)發(fā)芽率0.9150.337相對(duì)發(fā)芽指數(shù)0.8890.398相對(duì)活力指數(shù)0.7370.634相對(duì)總根長(zhǎng)-0.6610.638相對(duì)根系表面積-0.8190.544相對(duì)根系體積-0.8480.459相對(duì)根系平均直徑-0.7170.045相對(duì)根尖數(shù)-0.3310.538

2.4 紅三葉耐銅性隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)以及聚類分析

51份紅三葉種質(zhì)資源的相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)活力指數(shù)、相對(duì)總根長(zhǎng)等3項(xiàng)指標(biāo)為紅三葉耐銅性評(píng)價(jià)指標(biāo)，以其變異系數(shù)賦予權(quán)重分別為0.41、0.43和0.16；以此計(jì)算綜合隸屬函數(shù)值(D值)(表6)。采用歐氏距離法對(duì)51份種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，51份紅三葉在歐氏距離5處可分為3個(gè)類群。其中第1類群包括編號(hào)為H 24、H 15、H 48、H 10、H 11和H 8等6份種質(zhì)資源，其耐銅性綜合隸屬函數(shù)值較大，耐銅性最強(qiáng)。第2類群耐銅性居中，包括H 23、H 3和H 21等19份種質(zhì)資源。第3類群耐銅性較弱，有H 16、H 45和H 47等26份種質(zhì)資源。

表6 51份紅三葉種質(zhì)資源耐銅性隸屬函數(shù)分析

編號(hào)指標(biāo)隸屬函數(shù)值相對(duì)發(fā)芽率相對(duì)活力指數(shù)相對(duì)總根長(zhǎng)綜合隸屬函數(shù)值排序H10.5330.4000.3340.44420H20.3840.2210.1550.27729H30.6020.6270.4940.5968H40.5450.4670.5120.50615H50.4310.1740.0000.25234H60.5060.2960.2170.36925H70.7150.3780.0290.46118H80.7060.7720.4460.6936H90.5880.4480.2770.47817H100.9630.8490.1830.7894H110.7250.7610.4330.6945H120.6000.3200.0070.38423H130.5970.4210.1470.44919H140.6880.4090.1320.47916H151.0000.9220.1060.8232H160.3960.2740.1550.30526H170.6840.5150.4420.57210H180.6830.5520.1110.53513H190.4930.6560.3960.54812H200.5520.5450.2880.50714H210.6800.5570.4670.5939H220.4460.4000.1820.38424H230.5580.7010.4380.6007H240.8940.9530.3000.8241H250.7170.5600.1350.55611H260.1490.4911.0000.43221H270.2570.1240.3830.22037H280.3500.1220.1990.22836H290.1570.0490.1670.11247H300.2470.2460.3340.26032H310.0750.0230.1660.06750H320.1490.1380.2880.16744H330.0470.0000.2230.05551H340.0730.0710.6150.15945H350.1030.1020.5060.16743H360.1000.1110.6090.18641H370.1470.1230.5650.20339H380.0600.0260.2460.07549

續(xù)表6

編號(hào)指標(biāo)隸屬函數(shù)值相對(duì)發(fā)芽率相對(duì)活力指數(shù)相對(duì)總根長(zhǎng)綜合隸屬函數(shù)值排序H390.0460.0480.5950.13546H400.2100.1790.5660.25433H410.1840.1810.7460.27330H420.1150.1460.4340.17942H430.2900.3620.9700.43022H440.0000.0310.4990.09348H450.1270.2950.7830.30427H460.1050.1310.6990.21138H470.1380.2160.9320.29828H480.6571.0000.7030.8123H490.1520.1670.3800.19540H500.2580.2280.3890.26631H510.2520.1410.4870.24235權(quán)重0.410.430.16

圖1 51份紅三葉種質(zhì)資源耐銅性聚類

3 討 論

3.1 耐銅性鑒定指標(biāo)的篩選及綜合評(píng)價(jià)方法

植物耐受銅脅迫的抗性機(jī)理非常復(fù)雜，可能表現(xiàn)為多種生理過程的綜合反應(yīng)[6]，多指標(biāo)的綜合鑒定極為重要。多指標(biāo)鑒定已成為鹽[7]、旱[8]、堿[9]、重金屬[10-11]等非生物脅迫抗性鑒定的共識(shí)。劉紅云[12]南粳39的根系凈伸長(zhǎng)量為指標(biāo)對(duì)167個(gè)水稻品種耐銅性進(jìn)行篩選。張黛靜等[13]利用根長(zhǎng)相對(duì)值、株高相對(duì)值、相對(duì)根系活力、總根長(zhǎng)相對(duì)值、根體積相對(duì)值和根表面積相對(duì)值等6個(gè)生長(zhǎng)生理指標(biāo)的相對(duì)值進(jìn)行平均隸屬函數(shù)和聚類分析，將37個(gè)小麥品種分為強(qiáng)、中、弱三大類。本研究利用主成分分析和相關(guān)性分析，從9個(gè)指標(biāo)中篩選出3個(gè)指標(biāo)(相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)活力指數(shù)和相對(duì)總根長(zhǎng))；并根據(jù)變異系數(shù)求出各指標(biāo)權(quán)重，進(jìn)行隸屬函數(shù)值計(jì)算，再利用聚類分析將51份紅三葉種質(zhì)資源分為3個(gè)耐銅性類群。本研究在較全面了解紅三葉銅脅迫條件下的萌發(fā)特性和根系生長(zhǎng)特性的前提下，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)眾多材料進(jìn)行耐銅性分類，較為準(zhǔn)確簡(jiǎn)捷，適用于大量材料耐銅性的初級(jí)篩選。

3.2 萌發(fā)期植物耐銅性特性

植物萌發(fā)期對(duì)外界環(huán)境較為敏感，對(duì)萌發(fā)期植物材料進(jìn)行抗性鑒定可操作性強(qiáng)、周期短、效率高[9，12]。銅主要積累在草本植物的根部，從而減少對(duì)地上部分的毒害作用[14-16]，根部危害較地上部更為明顯，危害發(fā)生時(shí)間更早；但不同植物種間以及同一植物的不同品種間對(duì)銅的耐受能力差異較大。與紅三葉同屬植物白三葉(T.repensL.)可在質(zhì)量比重1∶5的尾礦和蒸餾水的浸提液中萌發(fā)，但發(fā)芽率和胚根長(zhǎng)度顯著下降，銅尾礦中銅含量嚴(yán)重超過《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 15618-1995)三類標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到3 536.79 mg·kg-1。說明白三葉對(duì)銅脅迫的耐受能力較強(qiáng)，可作為銅尾礦修復(fù)的先鋒植物[17]。白三葉、紅豆草(OnobrychisviciaefoliaScop.)、檸條(CaraganakorshinskiiKom.)、胡枝子(LespedezabicolorTurcz.)等4個(gè)豆科植物的銅脅迫發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果表明，在CCu2+≤300 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，紅豆草的發(fā)芽率逐漸增加；CCu2+>300 mg·L-1后，隨著CCu2+濃度增加，發(fā)芽率顯著下降；而白三葉和檸條的發(fā)芽率在CCu2+≤300 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，呈不規(guī)律變化。胡枝子的發(fā)芽率始終隨著CCu2+>100 mg·L-1的濃度增加而下降。4種豆科牧草在CCu2+≤300 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，根系受影響無明顯規(guī)律。而CCu2+>300 mg·L-1后，根系受到明顯抑制，500 mg·L-1Cu2+時(shí)，僅紅豆草仍有根長(zhǎng)，其他3種牧草已無根系發(fā)育[18]。相比較而言，蔬菜種子黃瓜(CucumissativusL.)和蘿卜(RaphanussativusL.)較豆科牧草的耐銅性差。黃瓜和蘿卜分別在80、100 mg·L-1Cu2+時(shí)，發(fā)芽率受到抑制；在60、40 mg·L-1Cu2+時(shí)根長(zhǎng)受到抑制[19]。CCu2+≥80 mg·L-1時(shí)對(duì)大田作物小麥(TriticumaestivumL.)種子發(fā)芽及幼苗苗長(zhǎng)、根長(zhǎng)等有抑制作用[20]。本研究中用100 mg·L-1Cu2+脅迫時(shí)參試的51個(gè)紅三葉種質(zhì)資源的萌發(fā)指標(biāo)和根長(zhǎng)都有顯著抑制作用(p<0.05)，但根系增粗，可見紅三葉萌發(fā)期的耐銅性也較強(qiáng)。

4 結(jié) 論

100 mg·L-1Cu2+脅迫對(duì)紅三葉的萌發(fā)指標(biāo)和根長(zhǎng)有顯著抑制作用(p<0.05)，但促進(jìn)根系增粗；根據(jù)9個(gè)指標(biāo)相對(duì)值的兩兩相關(guān)性分析和主成分分析篩選出相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)活力指數(shù)和相對(duì)總根長(zhǎng)作為紅三葉萌發(fā)期耐銅性綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，51份紅三葉種質(zhì)資源分為三大類：H 24、H 15、H 48、H 10、H 11和H 8等6份為耐銅性紅三葉種質(zhì)資源，H 23、H 3和H 21等19份為中等耐銅紅三葉種質(zhì)資源，H 16、H 45和H 47等26份為不耐銅紅三葉種質(zhì)資源。