呂敏佳，古蕾，陳子鵬，王江林，孫雪萌，趙青*

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣東 廣州 511436；2.廣州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系，廣東 廣州 511436)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，目前肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)已是世界上第五大最常見的癌癥，也是三大導(dǎo)致癌癥相關(guān)疾病患者死亡的原因之一。天然反義RNA，又稱天然反義轉(zhuǎn)錄物(naturally antisense transcripts，NATs)，指在生物體中天然存在的與正義轉(zhuǎn)錄存在一定程度的互補(bǔ)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[1-7]。在人體中，NATs廣泛存在，約占整個(gè)基因組的22%[8-14]。深入研究NATs對(duì)認(rèn)識(shí)基因表達(dá)調(diào)控、疾病早期診斷、治療以及預(yù)后具有重要的意義。TSPAN31是體內(nèi)天然存在的CDK4基因的NATs，TSPAN31可在宮頸癌中下調(diào)CDK4轉(zhuǎn)錄和翻譯[15]，但TSPAN31在肝癌細(xì)胞中對(duì)CDK4和相關(guān)細(xì)胞周期蛋白的作用仍未明確，且TSPAN31對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控的分子機(jī)制尚不清楚。本研究旨在研究TSPAN31在肝癌細(xì)胞中對(duì)CDK4及其相關(guān)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1、E2F1蛋白是否具有調(diào)控作用，并對(duì)TSPAN31進(jìn)行調(diào)控的分子機(jī)制進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721、BEL-7402，人宮頸癌細(xì)胞株Hela，人胚腎上皮細(xì)胞HEK293T，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。TSPAN31 siRNA、qRT-PCR Primer Set由銳博生物合成，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、BeyoECL Plus(超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒)購自碧云天生物技術(shù)研究所，兔抗CDK4、Cyclin D1、E2F1抗體購自Cell Signaling Technology公司，兔抗TSPAN31抗體購自Abcam公司，TaKaRa Ex Taq?、PrimeScript?RT-PCR Kit、PrimeScript?RT reagent Kit、SYBR?Premix Ex TaqTM購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) SMMC-7721、BEL-7402細(xì)胞用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基置于37℃、二氧化碳濃度5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度過高時(shí)需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。人宮頸癌細(xì)胞株Hela，人胚腎上皮細(xì)胞HEK293T細(xì)胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2質(zhì)粒和siRNA轉(zhuǎn)染 細(xì)胞活力良好且數(shù)量足夠時(shí)，胰酶處理細(xì)胞，以4×105個(gè)/孔密度鋪板，無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)。進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作時(shí)細(xì)胞融合度要求在40%左右。使用ThermoFisher公司Lipofectamine 2000進(jìn)行質(zhì)粒和siRNA轉(zhuǎn)染，具體參考產(chǎn)品使用說明。轉(zhuǎn)染后6 h更換完全培養(yǎng)基，48 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3qRT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平 培養(yǎng)細(xì)胞，收集1.5×107細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞RNA，NanoDrope?ND-1000測(cè)定RNA的濃度及純度?？俁NA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄所用試劑盒為TaKaRa公司PrimeScript?RT reagent Kit，具體參考產(chǎn)品使用說明。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)，qRT-PCR中所使用的全部引物均委托TaKaRa公司進(jìn)行合成，引物序列見表1。PCR擴(kuò)增所用試劑盒為TaKaRa公司SYBR? Premix Ex TaqTM，具體參考產(chǎn)品使用說明。反應(yīng)結(jié)束后得到溶解曲線，以GAPDH為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.4免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染48 h后收取細(xì)胞，BAC試劑盒進(jìn)行蛋白定量，將蛋白樣品與適量的5×上樣緩沖液混合，100 ℃蛋白變性10 min。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，使用PVDF膜，286 mA恒定電流轉(zhuǎn)膜2 h。脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃孵育相應(yīng)一抗過夜，次日取出PVDF膜復(fù)溫，TBST配制與一抗相對(duì)應(yīng)的二抗溶液(1∶5000)，室溫?fù)u床孵育1 h。熒光成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果，拍照記錄。實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.5TSPAN31過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建 提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR及PCR擴(kuò)增TSPAN31 3’末端非翻譯區(qū)，TSPAN31編碼區(qū)及TSPAN31全長(zhǎng)序列，引物均委托生工有限公司進(jìn)行引物合成，引物序列見表1。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并使用回收試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物。對(duì)pires2-EGFP質(zhì)粒和回收后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行EcoR I和XhoI兩種酶的雙酶切。在PCR管中配制連接反應(yīng)體系，連接反應(yīng)后4 ℃過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α內(nèi)，涂布平板，篩選陽性克隆，擴(kuò)增后進(jìn)行菌落PCR鑒定及通用引物測(cè)序。提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒，用EcoR I與XhoI酶切鑒定后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組樣本比較使用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，多組樣本間的比較使用單因素方差分析。以P<0.05為判定差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TSPAN31與其靶基因CDK4的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物存在堿基互補(bǔ)配對(duì)

通過NCBI數(shù)據(jù)庫檢索，發(fā)現(xiàn)TSPAN31與其靶基因CDK4共同位于人12號(hào)染色體(圖1A)，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在3’末端非翻譯區(qū)存在517個(gè)堿基可互補(bǔ)配對(duì)，同時(shí)，NATsDB顯示，TSPAN31可以與其正義轉(zhuǎn)錄基因CDK4形成一對(duì)順式天然反義轉(zhuǎn)錄本，兩者構(gòu)成一種“tail-to-tail”結(jié)構(gòu)(圖1B)。

2.2 肝癌細(xì)胞中siRNA干擾TSPAN31后引起靶基因CDK4轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)

肝癌細(xì)胞BEL-7402中，使用特異性siRNA干擾TSPAN31后，qRT-PCR和免疫印跡檢測(cè)CDK4相對(duì)表達(dá)水平變化，見圖2。qRT-PCR顯示，siRNA干擾后與對(duì)照組相比，CDK4 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(*P<0.05，**P<0.01，圖2A)。免疫印跡蛋白條帶灰度分析顯示，siRNA干擾后與對(duì)照組相比，CDK4蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(**P<0.01，圖2B)。

2.3 siRNA干擾TSPAN31上調(diào)Cyclin D1、E2F1蛋白表達(dá)

肝癌細(xì)胞中siRNA干擾TSPAN31后，免疫印跡檢測(cè)siRNA干擾組與對(duì)照組TSPAN31、Cyclin D1與E2F1蛋白表達(dá)，蛋白條帶灰度分析顯示，siRNA干擾后與對(duì)照組相比，SMMC-7721及BEL-7402細(xì)胞中TSPAN31蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著降低，Cyclin D1、E2F1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增加(*P<0.05，**P<0.01，圖3)。

2.4 過表達(dá)TSPAN31 3’末端非翻譯區(qū)下調(diào)CDK4表達(dá)水平

合成過表達(dá)TSPAN31全長(zhǎng)質(zhì)粒、過表達(dá)TSPAN31編碼區(qū)質(zhì)粒、過表達(dá)TSPAN31 3’末端非翻譯區(qū)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞及Hela細(xì)胞后，qRT-PCR及免疫印跡檢測(cè)CDK4轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。qRT-PCR結(jié)果顯示，HEK293T細(xì)胞與Hela細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染過表達(dá)TSPAN31全長(zhǎng)質(zhì)粒、過表達(dá)TSPAN31 3’末端非翻譯區(qū)質(zhì)粒組與對(duì)照組相比較，CDK4 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(*P<0.05，**P<0.01，圖4A)。免疫印跡顯示，HEK293T細(xì)胞與Hela細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染過表達(dá)TSPAN31全長(zhǎng)質(zhì)粒、過表達(dá)TSPAN31 3’末端非翻譯區(qū)質(zhì)粒組與對(duì)照組相比較，CDK4 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(*P<0.05，**P<0.01，圖4B、C、D)。qRT-PCR及免疫印跡均顯示，轉(zhuǎn)染過表達(dá)TSPAN31編碼區(qū)質(zhì)粒與對(duì)照組相比，CDK4在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖4)

表1 引物序列表

AB

注：A：人12號(hào)染色體上的TSPAN31及與其位于反義鏈的CDK4；B：兩基因mRNA的互補(bǔ)關(guān)系

圖1 TSPAN31與靶基因CDK4存在天然反義轉(zhuǎn)錄關(guān)系

***2.01.51.00.50.0RelativeCDK4mRNAexpressionsiTSPAN41#2siTSPAN31#1siControluntreatedsiTSPAN41#2siTSPAN31#1siControluntreated2.01.51.00.50.0****Proteinlevel(CDK4.Actin-1)CDK4β-actinAB

注：A：qRT-PCR檢測(cè)siRNA干擾后CDK4 mRNA表達(dá)水平 B. 免疫印跡檢測(cè)siRNA干擾后CDK4的蛋白表達(dá)水平；與siControl組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖2 肝癌細(xì)胞BEL-7402中干擾TSPAN31上調(diào)CDK4轉(zhuǎn)錄及翻譯(n=3)

注：A：免疫印跡檢測(cè)siRNA干擾后TSPAN31蛋白以及信號(hào)通路蛋白Cyclin D1、轉(zhuǎn)錄因子E2F1的蛋白表達(dá)；B、C：免疫印跡蛋白灰度分析統(tǒng)計(jì)；與siControl組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖3 肝癌細(xì)胞中干擾TSPAN31上調(diào)Cyclin D1蛋白及E2F1蛋白表達(dá)(n=3)

注：A：qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染過表達(dá)TSPAN31編碼區(qū)(CDS)、3’末端非翻譯區(qū)(3’ UTR)、及全長(zhǎng)質(zhì)粒后與對(duì)照組相比HEK293T細(xì)胞及Hela細(xì)胞中CDK4的轉(zhuǎn)錄水平；B：免疫印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染過表達(dá)TSPAN31質(zhì)粒后與對(duì)照組相比HEK293T細(xì)胞及Hela細(xì)胞中CDK4的翻譯水平；C、D：免疫印跡結(jié)果灰度分析，與Mock組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖4 過表達(dá)TSPAN31對(duì)CDK4轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響(n=3)

3 討論

反義轉(zhuǎn)錄物通常通過與正義轉(zhuǎn)錄物的直接相互作用來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從天然反義轉(zhuǎn)錄物的廣泛存在來看，可以推測(cè)這是一種常見的生物學(xué)現(xiàn)象，其具體的分子機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜。一個(gè)反義RNA轉(zhuǎn)錄，可能直接或間接地促進(jìn)或抑制基因的表達(dá)，目前已發(fā)現(xiàn)的調(diào)控方式主要有轉(zhuǎn)錄碰撞、基因組堿基修飾、DNA甲基化、RNA剪接編輯、組蛋白修飾、RNAi、影響RNA翻譯和穩(wěn)定性等[16-17]。其調(diào)控方式呈多樣化，且可能不僅通過一種方式來實(shí)現(xiàn)對(duì)正義轉(zhuǎn)錄物的調(diào)控。目前研究已知很多天然反義轉(zhuǎn)錄物對(duì)癌癥的發(fā)生和發(fā)展有重要影響。TSPAN31作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的天然反義轉(zhuǎn)錄物，其功能和作用機(jī)制尚不明了。本研究發(fā)現(xiàn)了TSPAN31在肝癌細(xì)胞中對(duì)CDK4、細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1和轉(zhuǎn)錄因子E2F1均具有調(diào)控作用。Cyclin D1作為細(xì)胞周期蛋白，可通過與細(xì)胞周期蛋白激酶的相互作用影響細(xì)胞G1期向S期的轉(zhuǎn)化。E2F1作為轉(zhuǎn)錄因子，可受細(xì)胞周期蛋白激酶的調(diào)控，進(jìn)而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能影響基因的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞周期、增殖、分化及凋亡具有重要意義。TSPAN31對(duì)CDK4、Cyclin D1、E2F1的調(diào)控作用表明，TSPAN31的表達(dá)可能對(duì)肝癌細(xì)胞的生理活動(dòng)具有重要意義。TSPAN31如何調(diào)控Cyclin D1的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，多數(shù)的天然反義轉(zhuǎn)錄本是非編碼RNA，且多數(shù)的靶基因是編碼基因。例如，BDNF-AS作為腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的天然反義長(zhǎng)鏈非編碼基因(long non-coding RNAs，lncRNA)，在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，Rb)中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)BDNF-AS可以抑制腫瘤的增殖和遷移[18]。又如骨肉瘤中l(wèi)ncRNA FOXC2-AS1通過對(duì)靶基因叉頭框蛋白C2(fork head box protein C2，F(xiàn)OXC2)的調(diào)控，影響骨肉瘤細(xì)胞的阿霉素耐藥性[19]。而本研究所涉及的TSPAN31基因作為一個(gè)新的天然反義轉(zhuǎn)錄物，本身可以翻譯為Tetraspanin31蛋白，其表達(dá)量變化對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展可能也具有相應(yīng)影響。TSPAN31所調(diào)控CDK4又對(duì)細(xì)胞周期具有重要調(diào)節(jié)作用。兩者之間可能存在的調(diào)控關(guān)系對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有多方面的復(fù)雜作用。研究這兩者的關(guān)系以及調(diào)控的分子機(jī)制對(duì)認(rèn)識(shí)腫瘤的發(fā)病機(jī)制以及發(fā)現(xiàn)新的腫瘤篩查靶點(diǎn)具有重要意義。

有研究表明，形成反義轉(zhuǎn)錄關(guān)系的兩個(gè)基因所轉(zhuǎn)錄的mRNA可結(jié)合形成RNA-RNA結(jié)構(gòu)，如胃癌細(xì)胞中，AS1DHRS4可通過對(duì)DHRS4轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行配對(duì)，從而影響了mRNA的穩(wěn)定性，對(duì)DHRS4基因的翻譯造成影響[20]。依據(jù)TSPAN31與CDK4基因mRNA的重合部分，我們猜測(cè)，兩個(gè)基因可能在轉(zhuǎn)錄后，通過形成RNA-RNA雙鏈結(jié)構(gòu)，影響mRNA的穩(wěn)定性。為研究?jī)烧叽嬖诘膲A基配對(duì)區(qū)即TSPAN31 3’末端非翻譯區(qū)是否可以對(duì)CDK4起到調(diào)控作用，我們?cè)O(shè)計(jì)合成了TSPAN31-3’UTR、TSPAN31-CDS、TSPAN31- full length過表達(dá)質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染過表達(dá)TSPAN31-3’UTR質(zhì)?？梢允辜?xì)胞中CDK4轉(zhuǎn)錄及翻譯水平降低。同時(shí)，TSPAN31-full length的過表達(dá)同樣可以下調(diào)細(xì)胞中的CDK4轉(zhuǎn)錄及翻譯水平。而轉(zhuǎn)染過表達(dá)TSPAN31-CDS質(zhì)粒對(duì)CDK4的表達(dá)水平無顯著影響。我們初步認(rèn)為，TSPAN31是通過3’末端非翻譯區(qū)與CDK4轉(zhuǎn)錄的mRNA發(fā)生相互作用從而對(duì)CDK4在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)形成調(diào)控。這對(duì)認(rèn)識(shí)天然反義轉(zhuǎn)錄及腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制具有啟發(fā)意義，繼續(xù)深入研究天然反義轉(zhuǎn)錄物發(fā)揮調(diào)控作用的分子機(jī)制有助于更全面的認(rèn)識(shí)細(xì)胞中信號(hào)蛋白之間的調(diào)控作用，有助于進(jìn)一步指導(dǎo)腫瘤的早期篩查治療以及預(yù)后，對(duì)人類健康事業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

綜上述，本文通過設(shè)計(jì)合成特異性的siRNA及構(gòu)建相應(yīng)過表達(dá)質(zhì)粒，對(duì)此前研究甚少的基因TSPAN31的功能及作用的分子機(jī)制進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)TSPAN31可在肝癌細(xì)胞中調(diào)控CDK4、Cyclin D1以及轉(zhuǎn)錄因子E2F1蛋白的表達(dá)，TSPAN31對(duì)CDK4的調(diào)控作用主要是通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’末端非翻譯區(qū)與CDK4基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的相互作用實(shí)現(xiàn)的。有關(guān)TSPAN31如何調(diào)控CDK4、Cyclin D1表達(dá)的分子機(jī)制，值得進(jìn)一步研究。