嚴(yán)林清，張新貴，肖中舉△

(1.南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣州 510515；2.汕頭大學(xué)精神衛(wèi)生中心，廣東汕頭 515065)

初級(jí)聽(tīng)覺(jué)皮層(primary auditory cortex，A1)在雙耳整合中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，它接受來(lái)自丘腦的上傳投射和皮層間的相互投射[1-2]。通過(guò)整合同側(cè)和對(duì)側(cè)感覺(jué)的輸入，皮層神經(jīng)元在雙側(cè)信息整合上有多種功能表現(xiàn)。例如在聲音處理上，聲源定位主要依賴雙耳時(shí)間差(interaural time difference，ITD)和雙耳強(qiáng)度差(interaural level difference，ILD)[3]。A1作為聽(tīng)覺(jué)傳導(dǎo)通路到達(dá)大腦皮層的第1站，單側(cè)皮層損傷缺損實(shí)驗(yàn)證實(shí)A1參與聲源定位[4]，同時(shí)也存在雙耳整合神經(jīng)元，此類神經(jīng)元的拓?fù)鋵W(xué)分布是客觀存在[5]。

根據(jù)不同單側(cè)耳神經(jīng)元響應(yīng)特征把雙耳神經(jīng)元簡(jiǎn)單劃分為一側(cè)耳興奮，另外一側(cè)耳也興奮和一側(cè)耳興奮、另外一側(cè)耳抑制類神經(jīng)元[6]。對(duì)于雙耳整合神經(jīng)元的功能特點(diǎn)，目前普遍認(rèn)同的觀點(diǎn)是：神經(jīng)元編碼ITD或者ILD，進(jìn)而轉(zhuǎn)換為空間特征的信息，完成對(duì)聲音空間位置的編碼[7]。但上述研究局限在對(duì)聲源定位的研究上，對(duì)雙耳整合頻率研究的方法較傳統(tǒng)，因此與聲音頻率相關(guān)上雙耳整合的突觸機(jī)制并不清楚。通過(guò)多單位記錄手段證明，A1從淺層到深層的細(xì)胞集群具有相似的特征頻率(characteristics frequency，CF)，即具有相似功能或者相似的響應(yīng)特點(diǎn)[8]，也就是存在相似頻率垂直功能柱。但上述研究的局限性在于對(duì)對(duì)側(cè)優(yōu)勢(shì)耳響應(yīng)進(jìn)行了相似頻率的劃分，并沒(méi)有考慮同側(cè)耳(Ipsi)的輸入會(huì)對(duì)對(duì)側(cè)耳(Contra)造成的影響，因此單側(cè)耳響應(yīng)的頻率功能柱并不代表雙側(cè)耳(Bi)共同響應(yīng)的反應(yīng)特點(diǎn)。另外，由于A1第6層(layer 6，L6)位置較深的關(guān)系，記錄較難，并不能很好地在在體清醒動(dòng)物上開(kāi)展單細(xì)胞膜片鉗記錄，多單位記錄并不能精確地得到帶寬、CF等神經(jīng)元特征性變化的參數(shù)[9]。

本文首先在體清醒動(dòng)物單細(xì)胞貼附式記錄得到A1 L6同側(cè)有或者無(wú)聲響應(yīng)的神經(jīng)元雙耳整合后準(zhǔn)確的特征參數(shù)：閾值上20 dB帶寬(BW20)、反應(yīng)延時(shí)(Onset-Latency)、閾值(Threshold)、CF等，再通過(guò)在體全細(xì)胞膜片鉗的方法研究雙耳整合神經(jīng)元特征參數(shù)的突觸機(jī)制，最后用雙重免疫熒光標(biāo)記法證實(shí)同側(cè)聲刺激激活同側(cè)聽(tīng)皮層L6的抑制性神經(jīng)元，進(jìn)而可能參與調(diào)節(jié)對(duì)側(cè)響應(yīng)的抑制性輸入。

1 材料與方法

1.1材料 本實(shí)驗(yàn)采用在體清醒動(dòng)物的膜片鉗技術(shù)，所用的電極為玻璃電極，拉制后呈椎形，尖端直徑約1 μm，結(jié)合自動(dòng)推進(jìn)器能進(jìn)行精細(xì)操作；所使用的78只SPF級(jí)C57BL/ 6J雌性小鼠均由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，周齡6～8周。小鼠因?yàn)轶w質(zhì)量較輕，雌性小鼠也較安靜，清醒狀態(tài)下小鼠的肢體運(yùn)動(dòng)對(duì)被鉗制的細(xì)胞的穩(wěn)定性可以經(jīng)由訓(xùn)練控制，能在小鼠運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下還能記錄到被鉗制的細(xì)胞，因此小鼠比較適合做清醒動(dòng)物的在體膜片鉗記錄模型。實(shí)驗(yàn)全過(guò)程均在南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用管理委員會(huì)的批準(zhǔn)和監(jiān)督下進(jìn)行。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物手術(shù)準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)小鼠用戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔麻醉后，轉(zhuǎn)置于立體定位儀進(jìn)行定位，將頭背面向左傾斜70°左右并固定小鼠頭部。剪開(kāi)小鼠頭部皮膚和部分肌肉，充分暴露顳骨和頂骨，以后鹵上骨縫與骨隆交點(diǎn)為零點(diǎn)，旁開(kāi)0.3 mm，分別在距此點(diǎn)向前鹵方向1.5～3.0 mm處標(biāo)記A1的位置。并在小鼠非聽(tīng)覺(jué)相關(guān)核團(tuán)埋置參比電極，用牙科水泥將一根長(zhǎng)約1.5 cm的自制鐵釘固定在顱骨表面。待牙科水泥完全凝固后，將小鼠置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，頭釘末端插入一已經(jīng)固定在防震臺(tái)的金屬固定桿上的小孔里，調(diào)節(jié)好小鼠頭部讓其處于合適的體位，并上緊螺絲固定住頭釘，在體視顯微鏡下用小鉆頭在已經(jīng)標(biāo)記的A1位置的顱骨上鉆約0.5 mm×0.5 mm大小的顱窗，充分暴露聽(tīng)皮層，并保護(hù)好暴露的腦組織及創(chuàng)口。待第2天小鼠恢復(fù)清醒后給予動(dòng)物訓(xùn)練，動(dòng)物訓(xùn)練放在類似記錄時(shí)的環(huán)境下，小鼠每次訓(xùn)練2～4 h，每天3次，訓(xùn)練2 d，訓(xùn)練期間每隔1小時(shí)在紅外攝像頭下觀察并記錄老鼠的狀況，待小鼠能長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持安靜狀態(tài)后進(jìn)行記錄。

1.2.2在體清醒動(dòng)物細(xì)胞貼附記錄 細(xì)胞貼附式記錄(cell-attached recording)所用儀器有TDT system Ⅲ系統(tǒng)、膜片鉗放大器700B (Axon Instrument，美國(guó))和數(shù)模轉(zhuǎn)換器1440A (Axon Instrument，美國(guó))。通過(guò)軟件Clampex10.2 和Brainware控制實(shí)驗(yàn)條件和保存數(shù)據(jù)。找到聽(tīng)覺(jué)相關(guān)神經(jīng)元后，閉合場(chǎng)行頻率-強(qiáng)度掃描，純音序列強(qiáng)度：0～70 dB SPL(10 dB SPL的間隔)，線性頻率：2～48 kHz(1 kHz間隔)，上升/下降時(shí)間為5 ms，時(shí)程為50 ms，隨機(jī)給聲，每個(gè)聲音2次/秒，每個(gè)聲音重復(fù)3～5次。定義記錄側(cè)為給聲同側(cè)，Ipsi、Contra和Bi隨機(jī)給聲，并將神經(jīng)元的電活動(dòng)和聲音方案保存在軟件Brainware的DAM文件里和Clampex軟件的ABF文件里。在細(xì)胞外貼附的膜片鉗記錄實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)同側(cè)給聲觀察同側(cè)皮層神經(jīng)元是否有給聲后發(fā)放，如果發(fā)放數(shù)高于自發(fā)放的3倍的標(biāo)準(zhǔn)差定義為同側(cè)給聲響應(yīng)類神經(jīng)元，反之，則定義為同側(cè)給聲無(wú)響應(yīng)神經(jīng)元。

1.2.3在體全細(xì)胞記錄 全細(xì)胞記錄是以細(xì)胞貼附式記錄為基礎(chǔ)，達(dá)到高阻(GΩ)封接，給予一定負(fù)壓抽吸讓電極管內(nèi)的細(xì)胞膜撕裂，從而使電極內(nèi)液與細(xì)胞內(nèi)液的成份互相交換，可用不同鉗制方式反映膜電位或者膜電流的變化[10-11]。當(dāng)鉗制在0 mV時(shí)(鈉離子的平衡電位)，可記錄到抑制性突觸后電流(IPSC)；當(dāng)鉗制在-70 mV時(shí)(氯離子的平衡電位)，可記錄到興奮性突觸后電流(EPSC)。給聲方案如上，采取同一強(qiáng)度60 dB不同頻率(3～45 kHZ)隨機(jī)掃描3遍，聲音刺激方案保存在Brainware的DAM文件里，IPSC和EPSC的波形保存在Clampex軟件的ABF文件里面。在全細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)同側(cè)給聲觀察同側(cè)皮層神經(jīng)元是否有給聲后閾下輸入，如果疊加后的反應(yīng)波形大于基線的3倍標(biāo)準(zhǔn)差定義為同側(cè)給聲響應(yīng)類神經(jīng)元，反之，則定義為同側(cè)給聲無(wú)響應(yīng)類神經(jīng)元。

1.2.4灌注固定和雙重免疫螢光 為避免運(yùn)動(dòng)或者外在環(huán)境噪聲對(duì)小鼠造成的干擾，小鼠給聲前予以20%烏拉坦(0.45～0.50 mL/100 g)麻醉。固定頭部，一側(cè)外耳道口放置閉合聲場(chǎng)軟管(定義給聲同側(cè))，在屏蔽室內(nèi)隔音、避光放置3 h后單側(cè)給純聲90 min(12 kHz，60 dB，50 ms duration，給聲頻率2次/秒)。給聲結(jié)束后小鼠仍處于深度麻醉狀態(tài)，隨后立刻采用心臟灌流法，依次灌注4 ℃保存的冰凍0.9%生理鹽水和4%多聚甲醛各50 mL，固定后擇期進(jìn)行切片，切片厚度每片為40 μm。根據(jù)小鼠腦立體定位圖譜收集目標(biāo)腦片進(jìn)行免疫螢光雙染[12]。步驟如下：0.01 mol/L PBS漂洗3遍，每遍10 min；0.3%雙氧水孵育30 min(避光，防止雙氧水見(jiàn)光分解)；PBS漂洗3遍，每遍10 min；0.25% Triton(打孔用)孵育2 h；PBS漂洗3遍；2.5%山羊血清封閉2 h；一抗4 ℃孵育過(guò)夜(c-Fos∶sc-52為1∶500；Anti-GAD67 Antibody∶clone 1G10.2，1∶1 000，稀釋液為5%山羊血清)；復(fù)溫后用0.01 mol/L PBS漂洗3遍，每遍10 min；二抗室溫避光孵育2 h(Alexa Fluor?488 goat anti-mouse IgG (H+L)，1∶500；Alexa Fluor?594 goat anti-rabbit IgG(H+L)，1∶500，稀釋液為0.01 mol/L PBS)；PBS漂洗3遍；移至干凈的載玻片，自然風(fēng)干后封片，使用共聚焦顯微鏡(Nikon,A1R,Japan)觀察，大腦切片經(jīng)免疫熒光染色后，使用藍(lán)光(激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm)為激發(fā)光，可檢測(cè)到經(jīng)過(guò)GABAergric染色神經(jīng)元的胞體為黃綠色熒光；使用綠光(激發(fā)光波長(zhǎng)為568 nm)激發(fā)，可檢測(cè)到經(jīng)過(guò)c-fos蛋白的神經(jīng)元胞核為橙紅色熒光[13]，分別在低倍或者高倍進(jìn)行檢測(cè)，儀器會(huì)根據(jù)不同厚度的細(xì)胞層進(jìn)行分層掃描，把掃描到的染色結(jié)果保存為圖像。

A：不同頻率-強(qiáng)度純音組合刺激得到感受野的三組偽彩圖；B：與圖A對(duì)應(yīng)的刺激后時(shí)間直方圖；C：Contra和Bi所在頻率的發(fā)放曲線圖；D～E：Bi和Contra的CF和閾上20 dB帶寬(BW20)擬合曲線；F～G：△Threshold和△Latency的細(xì)胞數(shù)柱狀分布圖

圖1 同側(cè)無(wú)響應(yīng)神經(jīng)元電生理結(jié)果

A：不同頻率-強(qiáng)度純音組合刺激得到感受野的三組偽彩圖；B：與圖(A)對(duì)應(yīng)的刺激后時(shí)間直方圖；C：Ipsi、Contra和Bi所在頻率的發(fā)放曲線圖；D、F、G：CF位移、△Threshold和△Latency的細(xì)胞數(shù)柱狀分布圖；E：Bi和Contra BW20擬合曲線

圖2 同側(cè)有響應(yīng)神經(jīng)元電生理結(jié)果

2 結(jié) 果

2.1同側(cè)無(wú)聲響應(yīng)神經(jīng)元的雙耳反應(yīng)特點(diǎn) 圖1(A)Ipsi沒(méi)有TRFs，圖中有零散的自發(fā)放動(dòng)作電位數(shù)，Contra和Bi有TRFs，對(duì)純音的響應(yīng)呈V型。圖1(B)是與圖1(A)對(duì)應(yīng)的PSTH，Ipsi在50 ms給聲后沒(méi)有響應(yīng)，Contra和Bi在50 ms給聲后有PSTH，且發(fā)放類型較為一致。圖1(C)Contra和Bi的同一個(gè)同側(cè)無(wú)聲響應(yīng)神經(jīng)元的重合CF，重合頻率為20 kHZ。圖1(D)Bi和Contra的CF的擬合曲線參數(shù)：r=0.997 1，slope=1.004 4；Contra CF：(21.800 0±9.857 6)kHZ，Bi CF：(21.730 0±9.857 6)kHZ；t=0.141，P=0.89，n=15。Bi和Contra的CF改變差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。圖1(E)15個(gè)神經(jīng)元的Bw20擬合曲線參數(shù)：r=0.988 8，slope=0.994 4；Con-tra：(21.413 0±5.142 3)kHZ，Bi：(21.625 0±4.815 6)kHZ；t<-0.45，P=0.735，n=15。Contra和bi的Bw20改變差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。圖1(F)Contra和Bi的△Threshold有13個(gè)神經(jīng)元差值為0 dB，有2個(gè)神經(jīng)元差值為-10 dB，有1個(gè)神經(jīng)元差值為10 dB，而圖1(G)的△ Latency的神經(jīng)元分布有12個(gè)神經(jīng)元差值為0 ms，2個(gè)神經(jīng)元差值為-2 ms，1個(gè)神經(jīng)元差值為-1 ms。

A：全細(xì)胞模式下突觸后電流曲線；B：由圖(A)得到EPSCs和IPSCs的聽(tīng)覺(jué)優(yōu)勢(shì)度指數(shù)-頻率關(guān)系的趨勢(shì)圖；C：由圖3(B)得到各個(gè)頻率EADI和IADI的比值統(tǒng)計(jì)圖

圖3 同側(cè)有響應(yīng)神經(jīng)元的全細(xì)胞結(jié)果分析

A：c-fos陽(yáng)性表達(dá)腦片圖；B：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的柱狀統(tǒng)計(jì)圖；C：左圖為雙重免疫熒光染色腦片圖，右圖為局部放大圖，黑色箭頭所示為c-fos陽(yáng)性的GABAergic神經(jīng)元

圖4 同側(cè)給聲的c-fos蛋白表達(dá)結(jié)果

2.2同側(cè)有聲響應(yīng)神經(jīng)元的雙耳反應(yīng)特點(diǎn) 圖2(A)Ipsi、Contra和Bi分別有不同TRFs，Ipsi對(duì)純音的反應(yīng)較弱，CF在高頻位置，而Contra和 Bi對(duì)純音響應(yīng)較強(qiáng)，CF位置在不同的頻率，三者反應(yīng)類型都為V型。圖2(B)是與圖2(A)對(duì)應(yīng)的PSTH，三者在50 ms給聲后都有反應(yīng)，Contra的動(dòng)作電位發(fā)放數(shù)最多，三者發(fā)放類型較為一致。圖2(C)Ipsi、Contra和Bi的同一個(gè)同側(cè)有聲響應(yīng)神經(jīng)元分別有不同的CF，Ipsi為44 kHZ，Contra為26 kHZ，Bi為39 kHZ。圖2(D)13個(gè)同側(cè)有聲響應(yīng)神經(jīng)元中有7個(gè)CF有位移，3個(gè)CF無(wú)變化，3個(gè)因?yàn)镃F在高頻位置無(wú)法辨認(rèn)。圖2(E)13個(gè)同側(cè)有聲響應(yīng)神經(jīng)元中的Contra和Bi的Bw20擬合曲線參數(shù)：r=0.971 2，slope=0.993 7；Contra：(19.615 0±6.252 2)kHZ，Bi：(19.923 0±6.909 7)kHZ；t<-0.47，P=0.647，n=13。Contra和Bi的Bw20改變差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。圖2(F)Contra和Bi的△Threshold有11個(gè)神經(jīng)元差值為0 dB，有1個(gè)神經(jīng)元差值為-10 dB，有1個(gè)神經(jīng)元差值為10 dB，而(G)的△ Latency有11個(gè)神經(jīng)元差值為0 ms，1個(gè)神經(jīng)元差值為-2 ms，1個(gè)神經(jīng)元差值為-1 ms。

2.3同側(cè)有聲響應(yīng)神經(jīng)元的全細(xì)胞反應(yīng)特點(diǎn) 圖3(A)Ipsi、Contra和Bi都有IPSC和EPSC，IPSC的幅度值較弱，Contra和Bi的IPSC和EPSC較強(qiáng)。圖3(B)中，CF及其附近(矩形灰框)的IADI值較高，而EADI變化不明顯。圖3(C)IADI的值為(0.180 0±0.190 0)pA/kHZ，EADI的值為0.095 0±0.940 0 (pA/kHZ)(t=-3.275，P<0.01，n=43)，EADI和IADI的變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4同側(cè)響應(yīng)的神經(jīng)元的c-fos變化特點(diǎn) 從圖4(A)EG有黑色點(diǎn)密集分布在L5和L6，CG則是零散分布。圖(B)中EG和CG的c-fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-13.98，P<0.01，n=10)。圖4(C)有神經(jīng)元表達(dá)c-fos蛋白(橙紅色標(biāo)記細(xì)胞核)，也存在GABAergic神經(jīng)元(黃綠色標(biāo)記胞體)，同時(shí)也有大量表達(dá)c-fos蛋白的GABAergic神經(jīng)元(兩種顏色均標(biāo)記)。

3 討 論

動(dòng)物在麻醉狀態(tài)下，聽(tīng)皮層神經(jīng)元的活動(dòng)降低，對(duì)聲音的反應(yīng)延時(shí)、延長(zhǎng)[14]，在麻醉動(dòng)物上得到A1 L6雙耳整合的結(jié)果并不能很好地反映神經(jīng)元的真實(shí)響應(yīng)。本文在清醒動(dòng)物上開(kāi)展對(duì)聽(tīng)皮層L6的雙耳整合的電生理研究，更能還原小鼠在自然狀態(tài)下雙耳整合的結(jié)果。下丘雙耳整合研究的機(jī)制當(dāng)中，雙耳響應(yīng)增益值的大小主要依賴賴于ILD[15]，當(dāng)雙耳給予相同的聲音，Ipsi的輸入并不影響Contra的反應(yīng)特性(圖1)，特別是CF(圖1C)，說(shuō)明同側(cè)無(wú)聲響應(yīng)神經(jīng)元并不影響對(duì)側(cè)的CF，因此這類神經(jīng)元接受的輸入可能并不在皮層發(fā)生整合，有可能接受下丘或者更低位核團(tuán)雙耳整合后的直接上傳的結(jié)果。A1 L6部分神經(jīng)元接受丘腦的直接輸入，比其他層有著更短的反應(yīng)延時(shí)，而且反饋投射到丘腦核團(tuán)，其投射的復(fù)雜性取決于該層神經(jīng)元有著復(fù)雜的細(xì)胞種類[16]，該層除了存在同側(cè)無(wú)聲響應(yīng)神經(jīng)元外，也存在同側(cè)有聲響應(yīng)的神經(jīng)元(圖2)，本文結(jié)果證實(shí)了該層存在同側(cè)聲響應(yīng)的神經(jīng)元，而且這類神經(jīng)元能夠改變對(duì)側(cè)響應(yīng)的CF(圖2C～D)，同一神經(jīng)元Ipsi的輸入可能與Contra的輸入可能發(fā)生皮層內(nèi)的整合，導(dǎo)致同側(cè)給聲后，對(duì)側(cè)響應(yīng)的CF發(fā)生偏移(圖2C～D)。之前的研究證實(shí)，聽(tīng)覺(jué)皮層神經(jīng)元的TRFs受興奮性和抑制性輸入整合的影響，當(dāng)興奮或者抑制發(fā)生改變，神經(jīng)元響應(yīng)的基本特性會(huì)發(fā)生改變[17-18]。在全細(xì)胞記錄模式下，更能清楚地看到興奮性和抑制性輸入的變化(圖3)，本實(shí)驗(yàn)同側(cè)和對(duì)側(cè)刺激都存在輸入的情況下，證實(shí)了同一個(gè)神經(jīng)元同時(shí)接受同側(cè)和對(duì)側(cè)的兩種輸入(EPSCs和IPSCs)，當(dāng)雙耳同時(shí)給聲時(shí)，同側(cè)影響了對(duì)側(cè)的抑制性輸入(圖3C)，特別在CF附近抑制作用更強(qiáng)(圖3B)，這種同側(cè)的干預(yù)對(duì)對(duì)側(cè)響應(yīng)的CF有修飾加工作用。c-fos基因參與機(jī)體眾多功能活動(dòng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控過(guò)程，特別是腦神經(jīng)功能活動(dòng)，多種刺激因子，如應(yīng)激、聲光刺激、體感刺激等均可誘導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)中c-fos基因的表達(dá)。細(xì)胞受刺激后，胞核內(nèi)c-fos基因被激活，轉(zhuǎn)錄形成mRNA,后者進(jìn)入胞質(zhì)，翻譯合成相對(duì)分子質(zhì)量55×103的核酸蛋白，即Fos蛋白。Fos蛋白經(jīng)磷酸化修飾后返回胞核內(nèi)與另一家族原癌基因c-jun編碼的Jun蛋白形成復(fù)合物。Jun與哺乳動(dòng)物基因轉(zhuǎn)錄因子AP-1結(jié)構(gòu)、功能相似，Jun/Ap-1為其表示形式。Fos和Jun/AP-1通過(guò)各自的a-螺旋區(qū)以光價(jià)鍵結(jié)合形成亮氨酸拉鏈，F(xiàn)os-Jun/AP-1復(fù)合物與目的基因結(jié)合，激活目的基因的轉(zhuǎn)錄活性。通過(guò)上述過(guò)程，細(xì)胞外的各種刺激信號(hào)轉(zhuǎn)化為調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)基因表達(dá)的信號(hào)，產(chǎn)生細(xì)胞的刺激效應(yīng)，可作為接受某種特定刺激的神經(jīng)元激活的標(biāo)記，是目前較為理想的神經(jīng)功能活動(dòng)的定位標(biāo)記[19]。聽(tīng)覺(jué)信息在上橄欖復(fù)合體(superior olive complex，SOC)開(kāi)始交叉?zhèn)鞯綄?duì)側(cè)皮層[20]。雙耳同時(shí)給聲后，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)同側(cè)聲輸入會(huì)影響對(duì)側(cè)響應(yīng)的CF，同側(cè)的聲輸入沒(méi)有直接上傳到同側(cè)皮層的傳導(dǎo)通路，因?yàn)槁曇粜畔⑹茄刂鴮?duì)側(cè)交叉上傳到對(duì)側(cè)A1加工處理。由于兩側(cè)大腦皮層間通過(guò)胼胝體存在大量的互相傳導(dǎo)纖維[21]，同側(cè)聲輸入傳到對(duì)側(cè)皮層后，有可能經(jīng)胼胝體傳到同側(cè)皮層的某一類神經(jīng)元對(duì)對(duì)側(cè)CF產(chǎn)生影響。為了觀察同側(cè)聲輸入是否能引起同側(cè)初級(jí)皮層神經(jīng)元的活動(dòng)，本實(shí)驗(yàn)先采用單獨(dú)Ipsi連續(xù)給聲90 min的方法，再取材染色，發(fā)現(xiàn)同側(cè)A1的L6同側(cè)給聲跟同側(cè)不給聲的空白對(duì)照組(圖4A)的c-fos蛋白相比有明顯差異(圖4B)，這就定位到同側(cè)給聲后同側(cè)聽(tīng)皮層L6有神經(jīng)元產(chǎn)生同側(cè)響應(yīng)，使得神經(jīng)元產(chǎn)生動(dòng)作電位發(fā)放活動(dòng)性指標(biāo)的變化，持續(xù)性的動(dòng)作電位發(fā)放能使c-fos基因激活持續(xù)表達(dá)c-fos蛋白，可以在形態(tài)學(xué)直觀看到同側(cè)給聲后神經(jīng)元響應(yīng)的位置，證實(shí)同側(cè)給聲有到同側(cè)皮層的間接通路。雙側(cè)同時(shí)給聲時(shí)，同側(cè)聲輸入使得同側(cè)L6產(chǎn)生有動(dòng)作電位發(fā)放的活性神經(jīng)元，這類神經(jīng)元有可能對(duì)對(duì)側(cè)響應(yīng)的CF產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，但不清楚是抑制性中間神經(jīng)元還是興奮性椎體神經(jīng)元對(duì)CF產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。已有文章證實(shí)，對(duì)側(cè)聽(tīng)覺(jué)皮層有纖維投射到同側(cè)L5抑制性中間神經(jīng)元的通路，這類抑制性神經(jīng)元能特異性調(diào)節(jié)椎體神經(jīng)元的活動(dòng)[22]；L5和L6同是信息輸出層，有相似的功能，參與離皮層投射，有大量纖維投射到丘腦和下丘，參與調(diào)節(jié)椎體神經(jīng)元的活動(dòng)[23]。本實(shí)驗(yàn)記錄到雙側(cè)給聲后CF的改變是跟抑制性變化相關(guān)，然后再行免疫熒光雙染實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在L6有大量的抑制性神經(jīng)元表達(dá)c-fos蛋白(圖4C)，而同側(cè)聲輸入沒(méi)有直接上傳到同側(cè)皮層的通路，這更加證實(shí)了同側(cè)聲輸入可能經(jīng)過(guò)對(duì)側(cè)皮層跨胼胝體到達(dá)同側(cè)L6的抑制性神經(jīng)元調(diào)節(jié)對(duì)側(cè)響應(yīng)的CF，實(shí)驗(yàn)中通過(guò)持續(xù)給聲激活神經(jīng)元的c-fos基因，抑制性神經(jīng)元的發(fā)放頻率較椎體神經(jīng)元快[24]，c-fos蛋白的表達(dá)跟神經(jīng)元的放電率有直接關(guān)系，發(fā)放率越高，相同時(shí)間內(nèi)細(xì)胞受到的刺激越多，c-fos表達(dá)就越強(qiáng)，同側(cè)接受相同聲音刺激時(shí)，抑制性神經(jīng)元的快放電率特征有調(diào)節(jié)其他神經(jīng)元活動(dòng)的優(yōu)勢(shì)，雙耳整合后由于抑制性輸入發(fā)生變化導(dǎo)致CF改變的原因更有可能是因?yàn)橐种菩陨窠?jīng)元的快放電率引起的，抑制性神經(jīng)元能提供其他神經(jīng)元抑制性輸入，參與抑制性調(diào)節(jié)。在聽(tīng)覺(jué)皮層，存在許多不同種類的抑制性神經(jīng)元，突觸的抑制參與了感受野的形成，加強(qiáng)聽(tīng)覺(jué)時(shí)間信息的認(rèn)知和調(diào)節(jié)增益值[25]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)雙重免疫熒光染色，證實(shí)同側(cè)給聲激活了大量聽(tīng)皮層L6的GABAergic神經(jīng)元(圖4)，而全細(xì)胞結(jié)果又證明了對(duì)側(cè)響應(yīng)的抑制性輸入被同側(cè)輸入影響，導(dǎo)致興奮-抑制平衡失去同步變化趨勢(shì)，而同側(cè)激活大量的抑制性神經(jīng)元被認(rèn)為可能參與調(diào)節(jié)對(duì)側(cè)響應(yīng)。綜上所述，可以推測(cè)雙耳同時(shí)給聲時(shí)，得出結(jié)論：(1)同側(cè)無(wú)響應(yīng)神經(jīng)元的同側(cè)輸入并不影響對(duì)側(cè)響應(yīng)的CF；(2)同側(cè)有響應(yīng)神經(jīng)元的同側(cè)輸入對(duì)對(duì)側(cè)響應(yīng)的CF有修飾加工作用，雙耳同時(shí)給聲時(shí)，同側(cè)輸入影響對(duì)側(cè)的抑制性輸入，從而導(dǎo)致雙耳響應(yīng)中對(duì)側(cè)CF發(fā)生偏移；(3)同側(cè)輸入主要激活同側(cè)聽(tīng)皮層L6的抑制性神經(jīng)元，被激活的抑制性神經(jīng)元可能參與對(duì)側(cè)特性頻率的加工和修飾。