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        高通量測(cè)序結(jié)合傳統(tǒng)方法分析4 ℃下鮮切菠菜的菌群變化

        2019-05-23 03:37:02郁杰謝晶
        食品與發(fā)酵工業(yè) 2019年9期
        關(guān)鍵詞:菠菜單胞菌菌落

        郁杰,謝晶

        1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海,201306) 2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部冷庫(kù)及制冷設(shè)備質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(上海),上海,201306) 3(上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評(píng)價(jià)專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái),上海,201306) 4(上海海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,上海,201306)

        鮮切凈菜是以新鮮蔬菜為原料,經(jīng)過(guò)分揀、清洗、切分、包裝等一系列處理后制成的即用或即食的蔬菜制品,在行業(yè)內(nèi)也被稱為“最小加工(minimally processed)”產(chǎn)品,具有新鮮、便捷、營(yíng)養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái),我國(guó)鮮切蔬菜的消費(fèi)市場(chǎng)正逐年擴(kuò)大,但鮮切蔬菜本身含水量較高,又經(jīng)過(guò)切割等程序,導(dǎo)致汁液流失嚴(yán)重,這些受傷的組織為微生物提供營(yíng)養(yǎng),使多種微生物群落得以繁殖,導(dǎo)致腐敗,這直接限制了產(chǎn)品流通和貨架期。腐敗菌對(duì)鮮切蔬菜產(chǎn)生破壞的癥狀主要體現(xiàn)在褐變、產(chǎn)生異味、結(jié)構(gòu)喪失以及在較低程度上的軟腐,這極大地影響到消費(fèi)者的購(gòu)買(mǎi)欲望,國(guó)外已有學(xué)者指出:在鮮切蔬菜的貯藏過(guò)程中,腸桿菌、假單胞菌以及乳酸菌等腐敗菌的增長(zhǎng)與酸味、褐變、軟腐有強(qiáng)相關(guān)性[1-2]。目前對(duì)鮮切葉菜微生物的研究主要集中在保鮮技術(shù)、清洗方式以及致病菌等領(lǐng)域,對(duì)鮮切葉菜中特定腐敗菌的研究較少[3-4]。

        菠菜(SpinaciaoleraceaL.)是一種綠葉蔬菜,人們常常將其鮮切后置于4 ℃下售賣(mài)[5]。鮮切菠菜在貯藏過(guò)程中易受微生物的侵襲導(dǎo)致腐敗[6]。本研究借助高通量測(cè)序技術(shù)[7-9],結(jié)合傳統(tǒng)檢測(cè),全面地研究鮮切菠菜在0、4、8 d主要腐敗菌及其演替規(guī)律,解析腐敗菌的組成、生理生化特性、豐度及多樣性,以此為指導(dǎo)企業(yè)防腐殺菌、產(chǎn)品貯運(yùn)等工藝提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 菠菜的鮮切處理及分組

        菠菜:要求大小均一、色澤鮮綠、清潔、無(wú)明顯缺陷、無(wú)病蟲(chóng)毒害。大棚種植,于6月份采摘,采摘時(shí)間為上午5時(shí),溫度約25 ℃,濕度約70%RH,采后立即配送至實(shí)驗(yàn)室。經(jīng)去離子水清洗后,將樣品用已滅菌的不銹鋼菜刀距菠菜根部約3 cm處進(jìn)行鮮切,并在無(wú)菌條件下將鮮切菠菜隨機(jī)分為3大組,每大組分為3小組,每小組分裝80 g/盒,放入無(wú)菌塑料盒,并用透明保鮮袋包好,置于4 ℃下貯藏備用。

        1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

        1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑

        平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(PCA)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)、假單胞菌瓊脂培養(yǎng)基(CFC)、腸桿菌科瓊脂培養(yǎng)基(VRBDA)、葡萄球菌瓊脂培養(yǎng)基(MSA)、梭菌鑒別瓊脂(DRCA):青島海博生物技術(shù)有限公司;微生物生理生化微量鑒定管:青島海博生物技術(shù)有限公司;E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit:M5635-02,OMEGA公司;Qubit3.0 DNA檢測(cè)試劑盒:Q10212,Life;2×TaqMaster Mix:P111-03,Vazyme公司;MagicPure Size Selection DNA Beads:EC401-03,Transgen。

        1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器

        高速冷凍離心機(jī)(H-2050R-1型),長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司;高溫高壓滅菌鍋(HVE-50),日本Hi-rayama制造有限公司;PCR儀(T100TM)Thermal Cyeler,BIO-RAD;超凈工作臺(tái)(VS-1300L-U),上??蹈L丨h(huán)境科技有限公司;恒溫培養(yǎng)搖床(KYC-100C),上海圣科儀器設(shè)備有限公司;電泳儀(DYY-6C、DYCZ-21型),北京市六一儀器廠。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 感官評(píng)定

        挑選8名經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的人員進(jìn)行感官評(píng)定,每人每次評(píng)定設(shè)為3次。標(biāo)準(zhǔn)參照PAILLART等[10]方法,感官評(píng)估分為3步進(jìn)行:①評(píng)估葉條的整體顏色及表觀,②對(duì)消費(fèi)者的接受度進(jìn)行打分,③將葉片平鋪在白色背景下觀察葉片萎焉程度。以上指標(biāo)評(píng)定后分?jǐn)?shù)越高代表品質(zhì)越好,每項(xiàng)評(píng)定滿分為10分,每天評(píng)定1次。

        1.3.2 腐敗菌的分離純化

        (1)在無(wú)菌條件下隨機(jī)準(zhǔn)確稱取樣品10 g,剪碎并混勻,放入90 mL無(wú)菌生理鹽水(質(zhì)量濃度為8.5 g/L) 中,充分搖勻之后用1 mL移液槍加入含有9 mL的生理鹽水試管中進(jìn)行10倍遞增稀釋,稀釋成所需濃度,選取合適的稀釋濃度,吸取1 mL上述菌懸液,置于表1各個(gè)培養(yǎng)基中。

        (2)經(jīng)培養(yǎng)后,從各種培養(yǎng)基中挑取典型生長(zhǎng)的、形態(tài)不同的菌落,平板劃線法反復(fù)分離、純化3次,直至菌落的生長(zhǎng)狀態(tài)和形態(tài)特征表現(xiàn)一致時(shí)得到純的菌落,純菌落斜面接種,培養(yǎng)后于4 ℃保存。

        (3)每隔1 d進(jìn)行上述工作,培養(yǎng)條件見(jiàn)表1。

        表1 各種微生物菌相的培養(yǎng)條件Table 1 Culture conditions of various microorganisms

        1.3.3 菌懸液的制備及保種

        用接種環(huán)依次挑取經(jīng)過(guò)上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)帶有明顯特征的菌落,標(biāo)號(hào)見(jiàn)表1,分別接種至裝有5 mL滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的試管內(nèi),盡量保證所有數(shù)據(jù)采集完整,搖床37 ℃、160 r/min振蕩過(guò)夜。待菌懸液制備后,用移液槍從每支試管內(nèi)吸取0.1 mL菌液,垂直滴落在已凝固的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,均勻涂布,靜置10 min左右,于37 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)24 h,進(jìn)行保種,待單菌落生成后,置于4 ℃冰箱保藏備用,菌懸液置于冰箱內(nèi)備用。

        1.3.4 菌種的初步鑒定及計(jì)數(shù)

        (1)初步鏡檢:將已獲得純化的菌株進(jìn)行革蘭氏染色,并用顯微鏡油鏡觀察細(xì)胞個(gè)體形態(tài)、排列等,每一處理均設(shè)3次重復(fù),挑選最典型的菌落觀察。

        (2)生理生化鑒定:參照崔慧玲等[11]對(duì)鮮切菜品的鑒定圖譜,使用相應(yīng)的微生物生理生化微量鑒定管鑒定后,參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》、《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》,各項(xiàng)生理生化試驗(yàn)每一處理均設(shè)3次重復(fù),避免假陽(yáng)性的發(fā)生。

        (3)選取菌落總數(shù)在30~300 CFU范圍內(nèi)的平皿,菌落計(jì)數(shù)參考GB 4789.2—2016[12]中的平板計(jì)數(shù)法測(cè)定,用PCA培養(yǎng)基測(cè)定總菌數(shù)量。在以上鑒定的基礎(chǔ)上,用選擇性培養(yǎng)基CFC、VRBDA、MSA、DRCA根據(jù)已觀察形態(tài)及生理生化的結(jié)論初步測(cè)定假單胞菌、腸桿菌、微球菌、梭菌的菌落數(shù)得出在0、4、8 d的大致比例。

        1.3.5 總DNA的提取

        參照NIEMINEN等[13]的方法在無(wú)菌超凈工作臺(tái)中,隨機(jī)從不同袋子中選取不同部位的菠菜葉片,保證采集樣品的代表性,共稱取10 g菠菜葉片,置于無(wú)菌均質(zhì)袋中,加入90 mL的無(wú)菌生理鹽水(質(zhì)量濃度為8.5 g/L),劇烈振蕩1 min,取出樣品,靜置10 min后,在10 000 r/min下離心10 min,棄上清,取10 mL沉淀,置于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩kS后按照OMEGA試劑盒的方法操作,提取細(xì)菌總DNA,并用 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取效果。

        1.3.6 16S rDNA V3-V4區(qū)的PCR擴(kuò)增及Illumina雙末端測(cè)序

        在肖英平等[14]實(shí)驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上稍作改進(jìn),以上述提取的總細(xì)菌基因組DNA為模板,引物針對(duì)16S rRNA基因V3~V4區(qū)合成特異引物,利用341F:CCTACGGGNGGCWGCAG;805R:GACTACHVGGGTATCTAATCC引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,利用Qubit3.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)回收的DNA精確定量,按照1∶1的等量混合后測(cè)序,每個(gè)樣品DNA量取10 ng,最終上機(jī)測(cè)序濃度為20 pmol,將檢測(cè)后合格的樣品委托上海生工生物工程有限公司。

        1.3.7 生物信息學(xué)分析

        參照儲(chǔ)建軍等[15]方法進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控及過(guò)濾,包括:去除引物接頭序列、序列拼接、質(zhì)量剪切、去除非擴(kuò)增區(qū)域序列和嵌合體序列,隨后進(jìn)行blastn比對(duì),在97%的相似水平下進(jìn)行歸類,得到分類操作單元(operational taxonomic unit,OTU),以此得出每個(gè)OTU分類學(xué)信息。隨后以隨機(jī)抽到的序列數(shù)與香農(nóng)指數(shù)(Shannon)構(gòu)制稀釋度曲線曲線,評(píng)估樣品測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性。再者,基于得到的OTUs計(jì)算香農(nóng)指數(shù)(Shannon)、菌種豐富度指數(shù)(Chao1)、辛普森指數(shù)(Simpson)、覆蓋率(Coverage)和ACE等常用的Alpha生物多樣性指數(shù),衡量樣本中物種的多樣性[16],并且通過(guò)貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析,在科、屬水平上進(jìn)行群落豐度統(tǒng)計(jì)分析并作圖,得到微生物群落結(jié)構(gòu)組成,鑒定優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 感官評(píng)定及總菌

        圖1及圖2分別顯示了4 ℃下貯藏的鮮切菠菜感官評(píng)分、總菌及表觀變化。由圖可知,隨著貯藏時(shí)間的增加,鮮切菠菜的感官評(píng)價(jià)呈下降趨勢(shì),在第8天,其感官評(píng)分降至5分以下,變得不可接受,葉片出現(xiàn)大面積萎蔫、發(fā)黃并出現(xiàn)不同程度的軟腐,鮮切

        部位出現(xiàn)褐變,打開(kāi)包裝可明顯感受到腐臭味;而總菌含量隨著貯藏時(shí)間的增長(zhǎng)而增長(zhǎng),在第8天時(shí),超過(guò)6 lg CFU/g,兩者指標(biāo)具有相關(guān)性,在第8天,感官和總菌含量皆超出標(biāo)準(zhǔn),說(shuō)明已失去商品價(jià)值[17]。

        圖1 4 ℃下冷藏對(duì)鮮切菠菜感官品質(zhì)和菌落總數(shù)的影響Fig.1 Effects of cold storage at 4 ℃ on sensory quality and colony count of fresh cut spinach

        圖2 4 ℃冷藏條件下不同貯藏時(shí)期鮮切菠菜的品質(zhì)Fig.2 Quality of fresh cut spinach at different storage periods under 4 ℃ refrigeration

        2.2 腐敗菌的初步鑒定

        2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化實(shí)驗(yàn)

        共挑取特征菌落29個(gè),經(jīng)革蘭氏染色實(shí)驗(yàn),其中18株為革蘭氏陰性菌,11株為革蘭氏陽(yáng)性菌,各菌株的鏡檢及生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

        表2 各個(gè)菌株的鏡檢及生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Microscopic examination and physiological and biochemical results of various strains

        續(xù)表2

        菌種編號(hào)P2-0、P3-2、P2-4、D1-0、D1-4、P1-8、D2-8P2-2、P2-6、V1-0、V2-4、V1-8、V3-8P1-0、P2-8、V3-4、V2-8P1-0、P3-0、P2-4、P1-8、C1-0、C2-2、C1-4、C2-8P1-0、P2-4、M1-0、M2-0菌落干濕度濕潤(rùn)濕潤(rùn)濕潤(rùn)濕潤(rùn)濕潤(rùn)H2O2酶實(shí)驗(yàn)-++++氧化酶實(shí)驗(yàn)+--++明膠水解+-+++吲哚實(shí)驗(yàn)NT+-NTNT葡萄糖利用+++++V-P實(shí)驗(yàn)---++O-F實(shí)驗(yàn)OFFOF初步結(jié)論梭菌腸桿菌腸桿菌假單胞菌葡萄球菌

        2.2.2 腐敗菌的計(jì)數(shù)

        根據(jù)對(duì)29株菌株的鏡檢以及生理生化的鑒定結(jié)果,分別對(duì)0、4、8 d的樣品在不同培養(yǎng)基中的典型菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)并計(jì)算大致比例。由表3可知,在貨架期終點(diǎn)假單胞菌占比達(dá)到77.89%,為主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌;腸桿菌在貯藏過(guò)程中比例下降至21.99%;微球菌、梭菌占比較少,分別為0.55%、0.51%。

        表3 4 ℃條件下鮮切菠菜的菌群變化 單位:CFU/g

        2.3 高通量測(cè)序鑒定

        2.3.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控及稀釋度曲線

        由表4可知,3個(gè)樣品經(jīng)過(guò)測(cè)序后分別得到48 353、62 689、53 046條原始序列,經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制、去除非特異性擴(kuò)增序列和嵌合體得到44 183、50 954、46 064條有效序列,各個(gè)樣品的有效序列分別達(dá)到91.4%、81.3%、86.8%,片段長(zhǎng)度約428 bp,均達(dá)到生物信息分析的要求[18]。

        表4 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 4 The statistics results of sequence data

        構(gòu)建稀釋曲線可以反映樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理,本實(shí)驗(yàn)中,橫坐標(biāo)代表隨機(jī)抽取的序列數(shù)量,縱坐標(biāo)代表的是反映物種多樣性的Shannon指數(shù),當(dāng)曲線趨于平坦時(shí),說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大,可以反映樣品中絕大多數(shù)的微生物物種信息。圖3代表的是不同貯藏時(shí)期的3個(gè)樣品:當(dāng)測(cè)序數(shù)目分別達(dá)到44 183、50 954、46 064時(shí),Shannon指數(shù)達(dá)到2.19、2.95、2.57,此時(shí)繼續(xù)增加測(cè)序數(shù)據(jù)量?jī)H產(chǎn)生少量新的OTU,同時(shí)稀釋度曲線趨于平坦,這表明測(cè)序已趨于飽和,具有代表性。

        圖3 各個(gè)樣品稀釋性曲線Fig.3 Rarefaction curve of each samples

        2.3.2 Alpha多樣性分析

        在4 ℃條件下,鮮切菠菜貯藏過(guò)程中的Alpha多樣性指數(shù)變化如表5所示。首先,各個(gè)樣品的Coverage指數(shù)均≥0.95,說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的測(cè)序數(shù)量充分代表樣品的真實(shí)情況[19];從Chao1、ACE指數(shù)來(lái)看,貯藏4 d菠菜表面的菌群豐度最高,其次是0 d,最低的是8 d;從Shannon、Simpson指數(shù)來(lái)看:貯藏4 d菠菜表面的菌群多樣性也明顯高于0 d及8 d,以上說(shuō)明:貯存4 d的菠菜樣品表面的微生物群落結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜,這可能是由于在貯存初期(0~4 d)菠菜經(jīng)過(guò)鮮切處理后,導(dǎo)致組織液外滲,為微生物提供了較好的繁殖環(huán)境,導(dǎo)致豐度和多樣性上升,在貯存后期(4~8 d)優(yōu)勢(shì)腐敗菌憑借其競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì),消耗營(yíng)養(yǎng)底物,使得環(huán)境改變,導(dǎo)致菌群多樣性降低。

        表5 Alpha多樣性指數(shù)Table 5 Alpha diversity index

        2.3.3 細(xì)菌群落分析

        使用RDP classifier以及Blast分析對(duì)已得的OTU進(jìn)行物種分類,共鑒定到10門(mén),15綱,23目,52科,89屬。本文在科、屬的分類水平上進(jìn)行分析。

        2.3.3.1 基于科分類水平上的分析

        經(jīng)過(guò)鑒定,在科的分類標(biāo)準(zhǔn)下,不同貯藏時(shí)間的鮮切菠菜表面菌群的豐度情況如圖4所示。

        圖4 基于科分類水平上的樣品菌群分布圖Fig.4 Bacterial distribution based on the family taxonomical level

        由圖4得出,假單胞菌科和腸桿菌科是在整個(gè)貯藏期間的主要菌群結(jié)構(gòu),兩者占比90%以上,為優(yōu)勢(shì)腐敗菌;而其他分類的菌群豐度較低,都小于2%,這表明菌群的多樣性程度較高,而豐度較為集中。從菌群變化的角度來(lái)看,隨著貯藏時(shí)間的推移,假單胞菌科的豐度呈遞增趨勢(shì),從初始豐度的48.99%到貯藏末期的70.27%;而腸桿菌科則從初始豐度的48.62%不斷遞減至21.75%,其余菌群的微生物均保持在較低豐度,出現(xiàn)上述現(xiàn)象可能是以下原因?qū)е碌模?1)在樣品清洗后,假單胞菌科及腸桿菌科的微生物在菠菜葉片表面的黏附強(qiáng)于其他細(xì)菌,從而使二者的初始豐度較高[20];(2)鮮切菠菜在4 ℃低溫下貯藏會(huì)明顯抑制腸桿菌的生長(zhǎng)[21],而假單胞菌對(duì)低溫具有一定的耐受力[22],因此,假單胞菌生長(zhǎng)速度快于腸桿菌,導(dǎo)致腸桿菌的豐度不斷下降,另一方面,二者的增殖會(huì)相對(duì)抑制其他科微生物的增長(zhǎng)。

        2.3.3.2 基于屬分類水平上的樣品菌群分布圖

        經(jīng)過(guò)鑒定,在不同貯藏時(shí)期,鮮切菠菜表面的微生物在屬的分類水平下共得到89個(gè)屬,圖5為在屬的分類水平下豐度占比前十的菌群分布情況。在科水平下為優(yōu)勢(shì)腐敗菌的假單胞菌科,在屬的分類下包括:假單胞菌屬(Pseudomonas)、氮單孢菌屬(Azomonas),對(duì)于腸桿菌科,在屬的分類下主要包括:泛菌屬(Pantoea)、歐文氏菌屬(Erwinia)、布丘氏菌屬(Buttiauxella)、沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia),除了上述幾種外,豐度靠前的還有氮單孢菌屬(Azomonas)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)等。

        圖5 基于屬分類水平上的樣品菌群分布圖Fig.5 Bacterial distribution based on the genus taxonomical level

        由圖5可知,假單胞菌屬、泛菌屬是鮮切菠菜的初始優(yōu)勢(shì)菌屬,豐度分別達(dá)到47.84%、30.7%,而歐文氏菌屬、布丘氏菌屬為次優(yōu)勢(shì)菌屬,豐度為8.09%和4.64%;到了貯存中期,假單胞菌屬的豐度上升至58.25%,泛菌屬豐度下降至13.94%,歐文氏菌屬豐度基本保持不變?yōu)?.69%、布丘氏菌屬豐度小幅上升至9.73%;貯存末期,假單胞菌屬占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),豐度占比68.97%,而泛菌屬豐度僅占5.4%,歐文氏菌屬占比10.7%,布丘氏菌屬占比4%。

        已有文獻(xiàn)證實(shí),假單胞菌屬是許多果蔬植物的腐敗菌,由于其營(yíng)養(yǎng)方式多樣性及其生理特性,較為適應(yīng)鮮切菠菜表面的生長(zhǎng)環(huán)境[23],其豐度約占腐敗菌的50%~90%[24],這和本研究結(jié)果一致,在該屬中,熒光假單胞菌(P.fluorescens)是引起鮮切菠菜軟腐變質(zhì)的主要細(xì)菌[25],具有很強(qiáng)的產(chǎn)氨致腐能力,并且可通過(guò)PL編碼基因表達(dá)產(chǎn)生果膠酸裂解酶(Polygalacturonatelyase,PL),PL的合成不受碳源種類的影響,并且會(huì)破壞菠菜葉片組織引起軟腐[26]。其次,P.fluorescens表面的鞭毛蛋白對(duì)更好地定植于鮮切菠菜表面起到了重要作用[27],以上特點(diǎn)可能是其在整個(gè)貯藏期豐度變化的原因,而泛菌屬、歐文氏菌屬在低于10 ℃下生長(zhǎng)緩慢,在加上營(yíng)養(yǎng)底物被假單胞菌屬消耗,間接地抑制其生長(zhǎng)。軟腐歐文氏菌屬除了分泌少量PL外,還會(huì)分泌果膠甲基半乳糖醛酸酶(Pectin methyl-galacturonase,PML),有實(shí)驗(yàn)證明:PML在軟化菠菜組織的作用不明顯,但是PME和PL的協(xié)同作用下可完全降解菠菜細(xì)胞壁上的果膠,從而發(fā)生軟腐敗[28]。

        3 結(jié)論

        本實(shí)驗(yàn)借助高通量檢測(cè)技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)生理生化檢測(cè)技術(shù)探究在4 ℃貯藏條件下,鮮切菠菜不同貯藏時(shí)期的菌群變化,結(jié)論如下:

        鮮切菠菜在不同貯藏時(shí)期其微生物的多樣性以及豐度存在較大差異,共鑒定到10門(mén),15綱,23目,52科,89屬,其中假單胞菌科和腸桿菌科為優(yōu)勢(shì)菌科。

        在屬水平上,假單胞菌屬(47.84%)、泛菌屬(30.7%)、歐文氏菌屬(8.09%)、布丘氏菌屬(4.64%)是鮮切菠菜的主要初始菌群結(jié)構(gòu),到了貯存中后期,假單胞菌屬豐度不斷上升至68.97%,成為導(dǎo)致鮮切菠菜腐敗的主要菌屬,泛菌屬、歐文氏菌屬、布丘氏菌屬成為次要腐敗菌。

        本實(shí)驗(yàn)2種方法可進(jìn)行對(duì)比,進(jìn)一步驗(yàn)證了高通量檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)勢(shì),精確地定量了菌群組成比例。

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