喬潔，田曉飛，王晶，侯曉強(qiáng),*，韓美玲，耿曉進(jìn)，王聰艷

1(廊坊師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河北 廊坊，065000) 2(河北省食藥用菌資源高值利用技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 廊坊，065000) 3(廊坊市氣象局，河北 廊坊，065000)

滑銹傘屬(Hebelomasp.)真菌屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycete)、傘菌目(Agaricales)、球蓋菇科(Strophariaceae)[1]，廣泛分布于北半球的林中地上，可與巖薔薇屬(Cistus)、柳屬(Salix)、樺木屬(Betula)、椴樹屬(Tilia)、山毛櫸屬(Fagus)、松屬(Pinus)、冷杉屬(Abies)、云杉屬(Picea)等屬植物形成外生菌根[2]。目前，我國(guó)對(duì)滑銹傘屬真菌的研究較少，主要集中在分類學(xué)研究方面。

大型真菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的萜類、醇類、酚類、酮類、氨基酸、多糖、維生素等次生代謝產(chǎn)物，具有抗菌[3]、抗氧化[4]或抗腫瘤[5]等生物活性，在不同的液體發(fā)酵培養(yǎng)基和不同發(fā)酵條件下，產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物含量不同[6-7]。因此大型真菌發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，對(duì)于提高菌絲體生物量和次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義，而滑銹傘液體發(fā)酵培養(yǎng)及發(fā)酵液抗菌活性的研究鮮有報(bào)道。

本研究采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，以滑銹傘菌絲體生物量為指標(biāo)，對(duì)滑銹傘液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化；同時(shí)采用牛津杯法和最低抑菌濃度法，研究滑銹傘液體發(fā)酵液的抗細(xì)菌活性，研究結(jié)果為滑銹傘的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生滑銹傘(Hebelomasp.)：采自廊坊自然公園；指示菌株：大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccusaureus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)由本實(shí)驗(yàn)室保藏，綠膿假單胞菌(Pesudomonasaeruginosa)購(gòu)自中科院微生物所菌種保藏中心；DNA Marker(DM2000)：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；PCR通用引物 ITS1 和 ITS4、PCR 擴(kuò)增試劑盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)北京公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：土豆200 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂18 g/L；察氏培養(yǎng)基(Czapek dox medium, CDM)：NaNO33 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO40.5 g/L，KCl 0.5 g/L，F(xiàn)eSO40.01 g/L，蔗糖30 g/L，pH 7.3±0.2；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.3±0.2。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHJH-C1115C智能型安全超凈工作臺(tái)，鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；BSD-YX2600雙層立式搖床，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；MLS-3750立式壓力蒸汽滅菌器，日本SANYO；BSA224S電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；ALPHA 1-2 冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Martin Christ GmbH；iMark酶標(biāo)儀，美國(guó)BIO-RAD。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 供試菌株形態(tài)學(xué)鑒定

將供試菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，27 ℃培養(yǎng)5 d，用打孔器(Φ=6 mm)在菌落邊緣取出菌餅轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上，27 ℃暗培養(yǎng)，記錄菌株生長(zhǎng)情況并拍照。

1.3.2 供試菌株分子生物學(xué)鑒定

將供試菌株接種在PD培養(yǎng)基上，27 ℃暗培養(yǎng)7～9 d后，采用ITS-rDNA 序列分子鑒定法進(jìn)行菌種鑒定。提取供試菌株DNA，采用真菌通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，反應(yīng)體系為：2×PCR Master Mix 25 μL、DNA模板0.5 μL、ITS1(10 μmol/L)2 μL、ITS2(10 μmol/L)2 μL、無菌雙蒸水20.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min、94 ℃變性1 min、55 ℃復(fù)性45 s、72℃延伸1 min、35個(gè)循環(huán)、72 ℃充分延伸8 min、4 ℃保溫。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。序列用SeqMan軟件進(jìn)行拼接，與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

1.3.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)

將滑銹傘菌絲塊接種到PDA培養(yǎng)基(培養(yǎng)皿Φ=9 cm)上進(jìn)行培養(yǎng)，27℃，培養(yǎng)10 d。刮取整個(gè)培養(yǎng)皿的滑銹傘菌絲體，接入裝有90 mL CDM培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，25 ℃，150 r/min，培養(yǎng)40 d。

1.3.4 菌絲體生物量測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液減壓抽濾，12 000 r/min離心10 min，收集菌絲，80 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒重，稱重(精確至0.000 1 g)，重復(fù)7次。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

選擇碳源、氮源2個(gè)單因素進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。碳源選擇乳糖、蔗糖、葡萄糖和麥芽糖4個(gè)水平，添加量均為30 g/L。氮源選擇牛肉膏、NaNO3、蛋白胨和NH4Cl四個(gè)水平，添加量均為3 g/L。按上述方法發(fā)酵培養(yǎng)40 d，測(cè)定菌絲體干重。

1.3.6 Plackett-Burman(P-B)試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，篩選出最優(yōu)的碳源與氮源，以菌絲生物量作為P-B試驗(yàn)的響應(yīng)值，對(duì)CDM培養(yǎng)基中的6個(gè)因子進(jìn)行全面考察，每個(gè)因子分為高、低2個(gè)水平， P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子水平表見表1。

表1 P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子水平表Table 1 Levels of variables for Packett-Burman experiment

1.3.7 響應(yīng)面試驗(yàn)

通過P-B試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)(central composition design，CCD)原理，對(duì)滑銹傘液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化[8]，并利用優(yōu)化的培養(yǎng)基進(jìn)行大量培養(yǎng)，與CDM培養(yǎng)基相比，測(cè)定菌絲體產(chǎn)量。

1.3.8 指示菌株活化

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌以及枯草芽孢桿菌分別接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.9 抗菌活性的測(cè)定

發(fā)酵液減壓抽濾，12 000 r/min離心10 min，取上清液低溫減壓濃縮至質(zhì)量濃度為200 mg/mL。調(diào)整4種指示菌濃度為105～106CFU/mL，分別取200 μL菌懸液均勻地涂布在PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)平皿中放置5只牛津杯，其中3只牛津杯中加入200 μL 200 mg/mL的滑銹傘發(fā)酵液，另2只牛津杯中分別加入200 μL 0.01 mg/mL的慶大霉素(G-)和CDM液體培養(yǎng)基作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)24 h，用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。根據(jù)抑菌圈大小判定細(xì)菌對(duì)滑銹傘發(fā)酵液的敏感度，根據(jù)抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)[9]，抑菌圈直徑d=8 mm為不敏感，8 mm

1.3.10 最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)的測(cè)定

發(fā)酵液減壓抽濾，12 000 r/min離心10 min，取上清液低溫減壓濃縮至質(zhì)量濃度為200 mg/mL。向50 mL錐形瓶中分別加入5 mL CMD液體培養(yǎng)基、500 μL不同質(zhì)量濃度的滑銹傘發(fā)酵液(15、20、25、35、50、100 mg/mL)和50 μL指示菌菌懸液(104～105CFU/mL)，混勻后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，分光光度計(jì)測(cè)定540 nm處的OD值，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低質(zhì)量濃度即為滑銹傘發(fā)酵液的MIC[9]。重復(fù)5次。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株的鑒定

利用通用引物ITS1和ITS4對(duì)該菌株的ITS基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后用SeqMan軟件進(jìn)行拼接，得到590 bp有效ITS基因序列，將該序列與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的序列進(jìn)行 BLAST比對(duì)分析，結(jié)果表明，該菌株的rDNA-ITS序列和Hebelomasp.(JX434647.1)的同源性為99%。

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 單因素試驗(yàn)

添加不同碳源，獲得的菌絲生物量也不同，但各處理間差異不顯著，菌絲體生物量的大小依次為：乳糖>葡萄糖>麥芽糖>蔗糖。乳糖作為碳源時(shí)菌絲生物量最高，為0.333 g/L，比蔗糖處理高66.5%。這可能是因?yàn)椴煌拇笮驼婢奶荚醋V不同，一些大型真菌的最佳碳源更偏向于乳糖[10]，半乳糖更易被滑銹傘利用，促進(jìn)了滑銹傘菌絲體的生長(zhǎng)。因此，選擇乳糖作為滑銹傘液體發(fā)酵培養(yǎng)基的最適碳源(圖1)。

圖1 不同碳源對(duì)菌絲生物量的影響Fig.1 The effects of different carbon source on mycelia biomass

添加不同氮源，菌絲體生物量差異顯著，菌絲生物量的大小依次為：牛肉膏>蛋白胨>NH4Cl>NaNO3。牛肉膏作為氮源時(shí)菌絲生物量最高，為0.667 g/L，比NaNO3處理高328%。牛肉膏中富含氨基酸、核苷酸、礦物質(zhì)及維生素類的水溶物質(zhì)，其成分和質(zhì)量好于蛋白胨及其他無機(jī)氮源，能夠較好的促進(jìn)滑銹傘菌絲體的生長(zhǎng)。因此，選擇牛肉膏作為滑銹傘液體發(fā)酵培養(yǎng)基的最適氮源(圖2)。

圖2 不同氮源對(duì)菌絲生物量的影響Fig.2 The effects of different nitrogen source on mycelia biomass

2.2.2 P-B試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)，確定了最初的發(fā)酵培養(yǎng)基為牛肉膏3 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO40.5 g/L，KCl 0.5 g/L，F(xiàn)eSO40.01 g/L，乳糖30 g/L。P-B試驗(yàn)對(duì)CDM培養(yǎng)基中的乳糖、牛肉膏、MgSO4、KCl、K2HPO4、FeSO4這6個(gè)組分進(jìn)行主效應(yīng)篩選，每個(gè)組分分別取高、低2個(gè)水平，測(cè)定菌絲體生物量。利用Design-Expert 7.0對(duì)P-B試驗(yàn)進(jìn)行主效應(yīng)分析[11]，分析結(jié)果見表2。

表2 因子模型的方差分析表Table 2 Anova for selected factorial model analysisofvariance table

注：**差異極顯著(P<0.01)

利用Design-Expert 7.0分析P-B試驗(yàn)結(jié)果，得到以菌絲生物量Y為響應(yīng)值的多元線性回歸方程：

Y=1.14+0.15×X1+0.14×X2-0.050X7

(1)

2.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

P-B試驗(yàn)表明，乳糖、牛肉膏這2個(gè)因子對(duì)菌絲生物量有極顯著影響，因此采用CCD試驗(yàn)對(duì)乳糖、牛肉膏這2個(gè)因子進(jìn)行分析。利用Design Expert 7.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，得到以菌絲生物量為響應(yīng)值的多元回歸方程：

(2)

式中，Y為菌絲生物量；X1、X2分別為乳糖和牛肉膏的編碼值。

表3 響應(yīng)曲面二次模型方差分析表Table 3Anova for response surface quadratic modelanalysis of variance table

注：**差異極顯著(P<0.01)；*差異顯著(P<0.05)。

圖3為乳糖和牛肉膏交互作用對(duì)菌絲生物量的影響。對(duì)方程(2)利用Design-Expert 7.0進(jìn)行分析，可以得到曲面的最大點(diǎn)，2個(gè)因子最優(yōu)試驗(yàn)點(diǎn)為乳糖30.26 g/L、牛肉膏3.05 g/L，即滑銹傘最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基為：乳糖30.26 g/L、牛肉膏3.05 g/L、KCl 0.5 g/L、MgSO40.5 g/L、K2HPO41 g/L、FeSO40.01 g/L。

圖3 乳糖和牛肉膏交互作用的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface plot of the interaction between lactose and beef extract on mycelia

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為進(jìn)一步檢驗(yàn)響應(yīng)面分析法的準(zhǔn)確性，在優(yōu)化條件下進(jìn)行5組搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，所得菌絲生物量為(9.15±0.61)g/L，模型預(yù)測(cè)值為9.10 g/L，該平均值與模型預(yù)測(cè)值非常接近，表明該模型可以在誤差允許范圍內(nèi)較好的預(yù)測(cè)滑銹傘液體發(fā)酵培養(yǎng)中的菌絲生物量。采用優(yōu)化后的液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)滑銹傘，其菌絲生物量是初始發(fā)酵培養(yǎng)基的26.60倍。

2.3 滑銹傘發(fā)酵液抗細(xì)菌活性測(cè)定

2.3.1 抗細(xì)菌活性測(cè)定

滑銹傘液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和綠膿假單胞菌的抗細(xì)菌活性均比優(yōu)化前高，結(jié)果如表4所示。發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化前，滑銹傘發(fā)酵液只對(duì)綠膿芽孢桿菌有抗菌活性，對(duì)其他3種指示菌均無抗菌活性，陰性對(duì)照對(duì)4種指示菌均無抗菌活性，陽(yáng)性對(duì)照對(duì)4種指示菌均有抗菌活性。敏感度結(jié)果顯示，綠膿假單胞菌對(duì)滑銹傘發(fā)酵液為中度敏感，4種指示菌對(duì)陽(yáng)性對(duì)照均為極高度敏感。發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化后，滑銹傘發(fā)酵液和陽(yáng)性對(duì)照對(duì)4種指示菌均有抗菌活性，但敏感度有所差異，陰性對(duì)照對(duì)4種指示菌均無抗菌活性。敏感度結(jié)果顯示，大腸桿菌對(duì)滑銹傘發(fā)酵液為中度敏感，枯草芽孢桿菌和綠膿假單胞菌對(duì)滑銹傘發(fā)酵液為高度敏感，金黃色葡萄球菌對(duì)滑銹傘發(fā)酵液為極敏感，4種細(xì)菌對(duì)陽(yáng)性對(duì)照均為高度敏感。抑菌圈直徑結(jié)果顯示，滑銹傘發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑最大，為(24.83±0.39)mm，比陽(yáng)性對(duì)照高28.45%；對(duì)大腸桿菌的抑菌圈最小，為(15.28±0.49)mm，比陽(yáng)性對(duì)照低17.40%；對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為20.39 mm，比陽(yáng)性對(duì)照高8.28%；對(duì)綠膿假單胞菌的抑菌圈直徑為18.33 mm，比陽(yáng)性對(duì)照低4.38%。由此推論，滑銹傘發(fā)酵液對(duì)4種指示菌的抗菌效果依次為：金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>綠膿假單胞菌>大腸桿菌。

2.3.2 最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)測(cè)定

注：字母不同表示差異顯著(P<0.05)；“-”表示抑菌圈直徑d=8 mm為不敏感；“+”表示8 mm

滑銹傘發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和綠膿假單胞菌的最低抑菌濃度結(jié)果如圖4所示。滑銹傘發(fā)酵液在質(zhì)量濃度<25 mg/mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用較強(qiáng)，對(duì)枯草芽孢桿菌和綠膿假單胞菌抑制作用其次，對(duì)大腸桿菌抑制作用較弱。當(dāng)滑銹傘發(fā)酵液質(zhì)量濃度≥20 mg/mL時(shí)，金黃色葡萄球菌吸光度趨近零，因此滑銹傘發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為20 mg/mL；枯草芽孢桿菌和綠膿假單胞菌隨滑銹傘發(fā)酵液質(zhì)量濃度的增加，生長(zhǎng)減慢，當(dāng)質(zhì)量濃度>20 mg/mL時(shí)，吸光值迅速降低，此濃度的滑銹傘發(fā)酵液對(duì)枯草芽孢桿菌和綠膿假單胞菌生長(zhǎng)抑制作用較強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為100 mg/mL時(shí)，枯草芽孢桿菌和綠膿假單胞菌的生長(zhǎng)幾乎被完全抑制，因此滑銹傘發(fā)酵液對(duì)枯草芽孢桿菌和綠膿假單胞菌的MIC為100 mg/mL；大腸桿菌的生長(zhǎng)隨滑銹傘發(fā)酵液質(zhì)量濃度的增加而緩慢降低，當(dāng)發(fā)酵液質(zhì)量濃度>100 mg/mL時(shí)，大腸桿菌吸光值趨近零，生長(zhǎng)被完全抑制，此濃度為其最低抑菌濃度。

圖4 滑銹傘發(fā)酵液對(duì)4種細(xì)菌的最低抑菌濃度曲線Fig.4 Minimum anti-bacterial concentrations ofHebeloma sp.

3 結(jié)論與討論

滑銹傘屬真菌屬于林木外生菌根真菌，接種該屬真菌能夠促進(jìn)林木幼苗的生長(zhǎng)[14-15]，并能夠生長(zhǎng)出子實(shí)體。有些種的子實(shí)體有毒性，如大毒滑銹傘、大孢滑銹傘、芥味滑銹傘等[16]；有些種可以食用，如長(zhǎng)根滑銹傘、高滑銹傘等，但目前尚未見有人工栽培的報(bào)道。食用菌栽培中，固體菌種制備時(shí)間長(zhǎng)，菌絲容易老化，液體發(fā)酵可縮短栽培周期，且有助于活性成分的研究及精深加工產(chǎn)品開發(fā)。本研究以滑銹傘作為試驗(yàn)材料，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用P-B試驗(yàn)和CCD試驗(yàn)，對(duì)滑銹傘液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，獲得了最佳的培養(yǎng)基組合，液體發(fā)酵菌絲生物量可達(dá)9.15 g/L，是初始發(fā)酵培養(yǎng)基的26.60倍，顯著提高了菌絲體的產(chǎn)量。液體發(fā)酵外生菌根真菌可為利用菌根技術(shù)植樹造林提供大量?jī)?yōu)質(zhì)菌種?；P傘屬真菌與宿主植物形成外生菌根過程中，HcMycE1基因?qū)τ诰z鞘和哈氏網(wǎng)的形成至關(guān)重要[17]；菌根的形成能夠顯著提高宿主幼苗的抗寒能力[18]；促進(jìn)銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的同化[19]；促進(jìn)宿主植物對(duì)土壤中磷元素的吸收，其中真菌HcPT2磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有重要作用[20]。

許多大型真菌對(duì)細(xì)菌或植物病原菌具有拮抗作用[21-22]，本研究發(fā)現(xiàn)采用優(yōu)化后的察氏培養(yǎng)基能夠提高滑銹傘發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和綠膿假單胞菌的抗菌活性，但抗菌活性有所差異。周玉芝等[23]研究發(fā)現(xiàn)，毛邊滑銹傘、大毒滑銹傘等菌根菌對(duì)立枯絲核菌、尖鐮孢菌、腐皮鐮孢菌等植物病原菌的營(yíng)養(yǎng)菌絲具有明顯的拮抗作用。邵紅軍等[24]利用色譜分離技術(shù)從西澳粘滑菇(H.westraliense)發(fā)酵液中分離得到5個(gè)化合物分別為volemolide、過氧化麥角甾醇、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)甲氧基苯乙酸和對(duì)羥基苯乙醇；從菌根真菌H.senescens子實(shí)體中也分離到羊毛甾烷三萜類、滑銹傘酸、無環(huán)倍半萜類等化合物[25]；這些化合物中對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯乙醇以及一些萜類化合物均具有抗菌活性，由此可見，滑銹傘屬多種真菌都能夠產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，本研究成果將為利用滑銹傘液體發(fā)酵開發(fā)新型抗菌藥物提供理論參考。