劉迪 羅猛 （通訊作者）

（貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州 貴陽 550002）

浸潤和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的顯著特征,目前尚未發(fā)現(xiàn)行之有效的治療策略來抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，因此世界范圍內(nèi)對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的研究方興未艾。最近研究發(fā)現(xiàn)，侵襲性偽足(InvadoPodia)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系[1]。位于染色體11q13區(qū)上的癌基因CTTN所編碼的皮層機動蛋白Cortactin (cortical actin bindingProtein)最初被發(fā)現(xiàn)是作為致癌的酪氨酸蛋白激酶v-src的底物，與微絲激動蛋白和致癌性酪氨酸激酶v-Src結(jié)合，從而影響細(xì)胞的侵襲性以及腫瘤轉(zhuǎn)移灶的形成[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，CTTN基因能夠促進(jìn)食管癌細(xì)胞系的運動和侵襲[3]。非小細(xì)胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)是造成肺癌相關(guān)死亡的主要原因。本研究旨在通過siRNA基因沉默技術(shù)檢測CTTN基因表達(dá)下調(diào)后對NSCLC中具有較強侵襲性的A549細(xì)胞株侵襲能力的影響。

1.材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

肺腺癌A549細(xì)胞(美國ATCC細(xì)胞庫)以含有10%胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)的DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)作為完全培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2濃度條件下常規(guī)培養(yǎng)。待其處于對數(shù)生長期時進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及免疫印跡

將A549細(xì)胞鋪于六孔板，每孔2ml完全培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合度達(dá)到60%左右時采用liPofectamine2000(美國Invitrogen公司)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將陰性siRNA和CTTN siRNA(廣州市銳博生物科技有限公司)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞(siRNA∶liPo 2000=5μl∶5μl)，48h后使用RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司)裂解細(xì)胞提取蛋白，SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離。冰水浴中100V，100min轉(zhuǎn)膜。脫脂奶粉封閉1h后，兔抗Cortactin蛋白一抗(稀釋比例1∶3500，美國Abcam公司)室溫孵育1h，山羊抗兔二抗(稀釋比例1∶5000，北京索萊寶科技有限公司)室溫孵育1h，加入ECL化學(xué)發(fā)光液后于美國AlPha公司Fluorchem Q型蛋白成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光，采用Imag J軟件分析條帶灰度值。

1.3 激光共聚焦顯微鏡檢測

1ml細(xì)胞懸液中計數(shù)3000個細(xì)胞加到直徑15mm的共聚焦小皿，待細(xì)胞其充分貼壁后，4%多聚甲醛固定，0.2%Triton-±s100破膜，兔抗cortactin-體(稀釋比1：1000)室溫孵育1h，羊抗兔dylight488熒光二抗(1：2000，美國Abbkine公司)再次室溫孵育1h，5μg/ml Tritc-鬼筆環(huán)肽(上海翊圣生物科技有限公司)室溫避光孵育30min后使用德國ZEISS公司LSM 700型激光共聚焦顯微鏡隨機選取5個視野，統(tǒng)計出現(xiàn)侵襲性偽足的細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)并計算百分率。

1.4 Transwell小室模型

實驗前一天將Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司)置于4℃冰箱中融化過夜。實驗時用預(yù)冷的槍頭抽取已用無血清培養(yǎng)基稀釋至1mg/ml的Matrigel基質(zhì)膠80μl，鋪于孔徑為8μm的Transwell小室(美國Corning公司)的膜上?；啄に螅瑥?×106/ml濃度的無血清細(xì)胞懸液中抽取200μl加至Transwell上室。24孔板下室加入700μl完全培養(yǎng)基。24h后，棄去孔中培養(yǎng)液，甲醇固定20分鐘，吉姆薩染色20min，PBS洗滌2遍后用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞。200倍顯微鏡下隨即五個視野觀察細(xì)胞，記數(shù)。

2.統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用率（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗，計量資料采用（±s）表示，進(jìn)行t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3.結(jié)果

3.1 siRNA沉默效率檢測

如圖1所示，western blot檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染CTTN基因的特異性siRNA(si-CTTN)后Cortactin蛋白表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。表明CTTN基因的沉默可以顯著抑制Cortactin蛋白的表達(dá)。

圖1 CTTN基因沉默效率檢測

3.2 CTTN的沉默抑制A549細(xì)胞株侵襲性偽足的形成

共聚焦顯微鏡下，呈現(xiàn)紅色熒光的TRITC-鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的F-actin和呈現(xiàn)綠色熒光的Dyligt488標(biāo)記的cortactin共定位于胞核周圍所呈現(xiàn)出的黃色熒光，即為侵襲性偽足。

如圖2所示，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與si-NC組的71.46±8.9%侵襲性偽足出現(xiàn)率相比，CTTN沉默(si-CTTN)組A549細(xì)胞中侵襲性偽足出現(xiàn)率顯著降低至22.37±4.8%(P＜0.05)。

圖2 CTTN基因沉默對A549細(xì)胞侵襲性偽足的影響 (bar=10μm)

3.3 CTTN的沉默降低A549細(xì)胞株侵襲能力

如圖3所示，Transwell細(xì)胞侵襲模型中，倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與si-NC組的220±27個侵襲細(xì)胞相比，CTTN的沉默導(dǎo)致侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低至51±10個（P＜0.05）。

圖3 CTTN基因沉默對A549細(xì)胞侵襲能力的影響（×200）

4.討論

無論是在我國還是在全球范圍內(nèi)，NSCLC都已成為致死率最高的惡性腫瘤[4]。30%早期階段的NSCLC患者可通過外科手術(shù)就能治愈肺癌。然而遺憾的是，NSCLC患者被發(fā)現(xiàn)時往往已處于腫瘤晚期，肺癌的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移導(dǎo)致患者已無法通過手術(shù)切除進(jìn)行治療。腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)也嚴(yán)重影響患者的預(yù)后，導(dǎo)致生存期顯著縮短[5]。因此，如何抑制惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移，從微生物學(xué)角度考慮如何抑制腫瘤細(xì)胞的運動侵襲，是目前腫瘤學(xué)研究的重中之重。

細(xì)胞偽足是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的主要“工具”，尤其是侵襲性偽足在細(xì)胞運動過程中扮演著非常重要的角色。肌動蛋白是細(xì)胞偽足的主要組成部分，也是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的主要參與蛋白[6]。另有文獻(xiàn)報道，活體熒光標(biāo)記肌動蛋白證實，微絲骨架在侵襲性腫瘤細(xì)胞偽足前沿的延展和形態(tài)構(gòu)建中發(fā)揮重要作用[7]。CTTN基因編碼的皮層蛋白(Cortactin)是一種微絲肌動蛋白結(jié)合蛋白，它可以與肌動蛋白微絲的側(cè)面結(jié)合，并直接參與細(xì)胞骨架的成型[8]。目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，cortactin是連接細(xì)胞骨架重建信號通路中的關(guān)鍵分子，在調(diào)控細(xì)胞的運動性、侵襲性、以及腫瘤轉(zhuǎn)移灶形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。目前已被證實Cortactin廣泛分布諸如層狀偽足、侵襲性偽足和細(xì)胞膜皺褶等細(xì)胞外圍[10]。同時發(fā)現(xiàn)，CTTN基因編碼的cortactin參與了眾多以肌動蛋白為基礎(chǔ)的過程。cortactin在腫瘤分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等病理情況下表達(dá)異常升高。

在本研究中，我們采用siRNA將CTTN基因進(jìn)行特異性沉默，并用western blot技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，Cortactin蛋白的表達(dá)被顯著抑制，證實了CTTN基因確實編碼Cortactin蛋白，并驗證了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染這種方法學(xué)的可靠性。在此基礎(chǔ)上，我們使用激光共聚焦顯微鏡和Transwell細(xì)胞侵襲小室模型發(fā)現(xiàn)，CTTN基因的沉默導(dǎo)致出現(xiàn)侵襲性偽足的細(xì)胞數(shù)顯著少于對照組，并且穿過Matrigel基質(zhì)膠侵襲至Transwell下室的細(xì)胞數(shù)顯著少于對照組，差異均差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。但是值得注意的是，本研究只是通過體外驗證CTTN基因參與調(diào)控細(xì)胞運動。動物模型及臨床出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的患者中CTTN基因及其編碼的Cortactin蛋白的檢測將是對本研究提供更強的說服力和可信度。