郭立斌，胡運(yùn)韜，何凱，王晶，許洋洋

青光眼是以眼壓升高為特征的致盲性眼病，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡和自噬過度、視網(wǎng)膜神經(jīng)層及視神經(jīng)萎縮是主要的病理特征，患者可逐步出現(xiàn)視野缺損、視力減退，直至失明[1-2]。高眼壓在青光眼的病情發(fā)展變化過程中起到至關(guān)重要的作用，降眼壓是臨床上治療青光眼的重要手段，在此基礎(chǔ)上需要保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞以達(dá)到改善視網(wǎng)膜神經(jīng)層厚度及視神經(jīng)功能的作用，進(jìn)而最大限度地保護(hù)青光眼患者的視力。雌激素不僅在女性生殖系統(tǒng)中發(fā)揮作用，還能在心臟、大腦等組織中發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[3-4]。已有研究報(bào)道雌激素在高眼壓動(dòng)物模型中能夠減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)中的細(xì)胞凋亡數(shù)目[5-6]，但關(guān)于雌激素調(diào)節(jié)眼壓水平的研究結(jié)果并不一致，也缺乏雌激素對(duì)視網(wǎng)膜中凋亡、自噬基因表達(dá)的影響。為了進(jìn)一步明確雌激素在高眼壓病理進(jìn)程中的治療作用，本研究具體分析了雌二醇(E2)對(duì)高眼壓大鼠眼壓、視網(wǎng)膜厚度及凋亡、自噬基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠24只,雄性, 3月齡，體質(zhì)量200～250 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SYXK2017-002，飼養(yǎng)溫度20～25℃、相對(duì)濕度50%～70%；經(jīng)裂隙燈檢查、眼部正常、無明顯疾病。(2)試藥試劑：E2、絲裂霉素購(gòu)自Sigma公司，4%多聚甲醛、蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒購(gòu)自碧云天公司，總RNA提取試劑盒、FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑盒、Talent熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京天根生物公司。(3)儀器設(shè)備：TonoLab型眼壓儀購(gòu)自Tiolat公司，顯微鏡購(gòu)自Nikon公司，裂隙燈購(gòu)自北京拓普康醫(yī)療器械有限公司。

1.2 高眼壓模型建立 2016年3月—2018年6月在廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，SD大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、高眼壓組、E2組，每組8只。高眼壓組和E2組大鼠予5%水合氯醛腹腔注射麻醉后，再行右眼角結(jié)膜表面麻醉，在顯微鏡下剪開球結(jié)膜并對(duì)上鞏膜靜脈進(jìn)行電凝閉合，同時(shí)放置浸潤(rùn)了0.2 g/L的絲裂霉素C棉片。造模后第2天測(cè)定眼壓，若造模后眼壓穩(wěn)定大于造模前5 mmHg則認(rèn)為造模成功。對(duì)照組僅進(jìn)行右眼角結(jié)膜表面麻醉，不進(jìn)行其他特殊處理；E2組從造模后當(dāng)天開始進(jìn)行藥物干預(yù)，皮下注射100 μg/kg的E2(以植物油稀釋溶解)，隔天1次；高眼壓組給予等劑量植物油皮下注射，隔天1次。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法 (1)眼壓測(cè)定：造模前及造模后1周、2周、3周、4周時(shí)，分別采用眼壓儀測(cè)定眼壓水平。(2)視網(wǎng)膜厚度、視神經(jīng)纖維厚度測(cè)定：造模4周后，過量麻醉處死大鼠并立即摘除眼球，4%多聚甲醛固定24 h后進(jìn)行石蠟包埋、制作病理切片。采用HE染色試劑盒對(duì)切片染色后在顯微鏡下觀察，測(cè)量視網(wǎng)膜厚度、視神經(jīng)纖維厚度。(3)凋亡及自噬基因表達(dá)測(cè)定：取石蠟包埋的視網(wǎng)膜組織，采用總RNA提取試劑盒提取視網(wǎng)膜內(nèi)RNA，采用FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑盒將RNA合成為cDNA，取cDNA樣本2 μl與Talent熒光定量檢測(cè)試劑盒內(nèi)的檢測(cè)液10 μl、引物0.8 μl 、去離子水7.2 μl 混合成PCR反應(yīng)體系，按照95℃ 15 s、60℃ 20 s、72℃ 25 s反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，根據(jù)擴(kuò)增曲線得到循環(huán)閾值(Ct)，按照公式2-ΔΔCt計(jì)算mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠眼壓水平比較 造模前，3組大鼠眼壓水平比較無明顯差異(P>0.05)；與造模前比較，對(duì)照組大鼠眼壓水平無明顯變化(P>0.05)，高眼壓組和E2組造模后1～4周時(shí)眼壓水平均明顯升高(P<0.01)，且均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，但E2組眼壓水平與高眼壓組比較無明顯差異(P>0.05)，見表1。

2.2 3組大鼠視網(wǎng)膜厚度、視神經(jīng)纖維厚度比較 造模后4周時(shí)，視網(wǎng)膜厚度、視神經(jīng)纖維厚度比較，高眼壓組

表1 3組大鼠造模前后眼壓水平比較

表3 3組大鼠造模4周后視網(wǎng)膜中凋亡基因表達(dá)量比較

表2 3組大鼠造模后4周視網(wǎng)膜厚度、視神經(jīng)纖維厚度比較

2.3 3組大鼠視網(wǎng)膜中凋亡基因表達(dá)量 造模4周后，視網(wǎng)膜中Bax、Caspase-9、Caspase-3的mRNA表達(dá)量比較，高眼壓組>E2組>對(duì)照組，Bcl-2的mRNA表達(dá)量高眼壓組

2.4 3組大鼠視網(wǎng)膜中自噬基因表達(dá)量 造模4周后，與對(duì)照組比較，高眼壓組視網(wǎng)膜中mTORC1、LC3-II、Beclin-1的mRNA表達(dá)量高眼壓組均明顯高于E2組高于對(duì)照組(P均<0.05) ，見表4。

表4 3組大鼠造模4周后視網(wǎng)膜中自噬基因表達(dá)量比較

3 討 論

高眼壓是青光眼病程中的特征，持續(xù)存在的高眼壓能夠通過引起視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡來導(dǎo)致視力水平減退。因此，治療青光眼不僅需要降眼壓，還需要減輕視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡。馬雪云等[5]和李貞等[6]均報(bào)道了雌激素用于高眼壓動(dòng)物模型的價(jià)值，能夠減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡，但雌激素對(duì)高眼壓動(dòng)物模型眼壓水平影響的結(jié)果并不一致，馬雪云的研究認(rèn)為雌激素能夠使高眼壓動(dòng)物模型的眼壓水平降低，而李貞的研究認(rèn)為雌激素對(duì)高眼壓動(dòng)物模型的眼壓水平無明顯影響。本研究對(duì)高眼壓組大鼠眼壓水平的分析發(fā)現(xiàn)：高眼壓組大鼠造模后的眼壓水平明顯高于對(duì)照組，由此提示高眼壓模型大鼠建立成功、眼壓水平明顯升高。在使用E2對(duì)高眼壓模型大鼠進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)：E2組大鼠的眼壓水平明顯高于對(duì)照組且與高眼壓組比較無明顯變化。與李貞的研究結(jié)果一致，說明E2本身并不直接影響高眼壓模型大鼠的眼壓水平、不具備直接的降眼壓作用。

青光眼病程中持續(xù)高眼壓能夠損害視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)，并逐步引起視覺功能損害、嚴(yán)重者會(huì)發(fā)生失明。在高眼壓引起視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)損害的過程中，組織學(xué)上表現(xiàn)為視網(wǎng)膜厚度及視網(wǎng)膜神經(jīng)層厚度的丟失，這一組織學(xué)表現(xiàn)與視力水平下降、視野缺損的臨床表現(xiàn)相互吻合[7-8]。本研究對(duì)高眼壓組大鼠視網(wǎng)膜厚度及視神經(jīng)纖維厚度的分析發(fā)現(xiàn)：高眼壓組的視網(wǎng)膜厚度及視神經(jīng)纖維厚度均明顯低于對(duì)照組。E2在多種組織臟器中具有細(xì)胞保護(hù)作用，腦梗死以及脊髓壓迫模型中被證實(shí)能夠保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞，本研究在使用E2干預(yù)后觀察了高眼壓模型大鼠視網(wǎng)膜厚度及視神經(jīng)纖維厚度的變化，E2組的視網(wǎng)膜厚度及視神經(jīng)纖維厚度均明顯高于高眼壓組。這一結(jié)果表明E2能夠在高眼壓過程中增加視網(wǎng)膜厚度及視神經(jīng)纖維厚度、具有視網(wǎng)膜的保護(hù)作用。

在高眼壓引起視網(wǎng)膜內(nèi)細(xì)胞凋亡的過程中，線粒體凋亡途徑是發(fā)揮關(guān)鍵作用的凋亡機(jī)制[9]。Bcl-2/Bax是一對(duì)調(diào)節(jié)線粒體途徑凋亡的上游分子，兩者能夠通過在線粒體膜上形成同源二聚體或異源二聚體的方式來影響線粒體膜對(duì)細(xì)胞色素C的通透性，Bax所形成的同源二聚體能夠促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，Bcl-2與Bax所形成的異源二聚體則能阻礙細(xì)胞色素C的釋放[10-11]。由線粒體釋放進(jìn)入胞漿的細(xì)胞色素C能夠首先激活Caspase-9，進(jìn)而通過一系列級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)來使Caspase-3激活，最終通過活化的Caspase-3來介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12-13]。本研究對(duì)視網(wǎng)膜中線粒體凋亡基因的分析發(fā)現(xiàn)：高眼壓組視網(wǎng)膜中Bax、Caspase-9、Caspase-3的表達(dá)量明顯升高，Bcl-2的表達(dá)量明顯降低；在用E2干預(yù)后，E2組視網(wǎng)膜中Bax、Caspase-9、Caspase-3的表達(dá)量明顯降低，Bcl-2的表達(dá)量明顯升高。這一結(jié)果表明高眼壓能夠激活視網(wǎng)膜內(nèi)的線粒體途徑的凋亡，E2干預(yù)能夠調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax、阻礙線粒體途徑的凋亡。

細(xì)胞自噬是近年來新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式，又被稱為“Ⅱ型細(xì)胞凋亡”。在細(xì)胞經(jīng)歷外界傷害性刺激的過程中，適度激活自噬能夠通過清除細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白、受損細(xì)胞器的方式來增加細(xì)胞供能，有利于細(xì)胞耐受傷害性刺激；但持續(xù)激活的自噬不僅不會(huì)為細(xì)胞供能，還會(huì)加重細(xì)胞的損傷[14-15]。mTORC1是mTOR通路中的關(guān)鍵信號(hào)分子，能夠?yàn)榧?xì)胞自噬提供上游信號(hào)，通過下游Beclin1和LC3-II來促進(jìn)自噬小體的形成，進(jìn)而激活細(xì)胞的自噬過程并通過持續(xù)存在的自噬來引起細(xì)胞損傷[16-17]。本研究對(duì)視網(wǎng)膜中自噬基因的分析發(fā)現(xiàn)：高眼壓組視網(wǎng)膜中mTORC1、LC3-II、Beclin-1的表達(dá)量明顯升高；在用E2干預(yù)后，E2組視網(wǎng)膜中mTORC1、LC3-II、Beclin-1的表達(dá)量明顯降低。這一結(jié)果表明高眼壓能夠激活視網(wǎng)膜內(nèi)的細(xì)胞自噬，E2干預(yù)能夠阻礙細(xì)胞自噬。

綜上所述，雌二醇雖然對(duì)高眼壓大鼠的眼壓水平無明影響，但是能夠增加視網(wǎng)膜及視神經(jīng)纖維厚度、抑制視網(wǎng)膜內(nèi)的細(xì)胞凋亡及自噬，因而使用E2治療青光眼能夠起到保護(hù)視網(wǎng)膜的作用，有利于阻礙青光眼病程中視覺的損害。

利益沖突：無

作者貢獻(xiàn)聲明

郭立斌：負(fù)責(zé)研究設(shè)計(jì)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及論文撰寫；胡運(yùn)韜：負(fù)責(zé)研究指導(dǎo)、論文修改；何凱：參與動(dòng)物造模及眼壓、視網(wǎng)膜厚度、視神經(jīng)纖維厚度的測(cè)定；許洋洋、王晶：參與各基因表達(dá)的測(cè)定