侯家保，袁泉，萬杏，劉戀，趙博，吳洋

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院 麻醉科，湖北 武漢 430060）

腦缺血再灌注損傷是指缺血的腦組織經(jīng)治療后重新恢復(fù)血液供應(yīng)，但損傷進(jìn)一步加重的反常現(xiàn)象[1-2]。 由于其發(fā)病率、致殘率和病死率高，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類健康[3]。腦缺血再灌注損傷后如何實(shí)現(xiàn)神經(jīng)組織的自我修復(fù)是目前研究的熱點(diǎn)問題之一[2，4]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，膠質(zhì)細(xì)胞參與維持神經(jīng)元正常功能，分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，實(shí)現(xiàn)免疫應(yīng)答[5-6]。因此在腦缺血再灌注損傷時(shí)，膠質(zhì)細(xì)胞可以發(fā)生活化及參與調(diào)控炎癥因子和凋亡因子的表達(dá)，避免神經(jīng)炎癥反應(yīng)加重誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而使受損神經(jīng)元修復(fù)成為可能。新近研究表明，組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitor,HDACi）曲古抑菌素A 在腦缺血再灌注損傷中可以產(chǎn)生內(nèi)源性再生和恢復(fù)的保護(hù)效應(yīng)[7-9]。那么曲古抑菌素A 是否通過神經(jīng)炎癥和細(xì)胞凋亡途徑參與其中的保護(hù)效應(yīng)呢？目前并沒有詳細(xì)研究。本研究旨在探討曲古抑菌素A 預(yù)處理在腦缺血再灌注損傷中對(duì)炎癥因子和凋亡因子表達(dá)的影響及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康成年雄性Balb/c 小鼠30 只，體重18 ～ 22 g，購自武漢生物制品研究所。

1.2 動(dòng)物分組與實(shí)驗(yàn)方法

采用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)小鼠分為3 組，每組10 只。假手術(shù)組（S 組），僅做頸部打開手術(shù)；缺血再灌注組（IR 組），行頸部切口大腦中動(dòng)脈線栓（middle cerebral artery occlusion,MCAO）法手術(shù)；曲古抑菌素A預(yù)處理組（預(yù)處理組），復(fù)制腦缺血再灌注模型前連續(xù)3 d 腹腔注射曲古抑菌素A 5 mg/kg 后行MCAO 手術(shù)。通過缺血1 h、再灌注24 h 復(fù)制腦缺血再灌注模型。異氟烷深度麻醉小鼠，暴露左側(cè)頸外動(dòng)脈，向頸外動(dòng)脈內(nèi)插入一根6-0 單絲線栓直達(dá)大腦中動(dòng)脈分支處，線栓于大腦中動(dòng)脈中留置45 min 后小心取出，手術(shù)總時(shí)間約1 h。模型復(fù)制成功的標(biāo)志是小鼠在麻醉蘇醒后出現(xiàn)右前肢嚴(yán)重偏癱。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

MCAO 后再灌注24 h 處死小鼠，并取大腦皮質(zhì)組織。①制備石蠟切片，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，行HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)結(jié)果。②ELISA 檢測(cè)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）：腦皮層組織勻漿，離心后提取上清液。嚴(yán)格按試劑盒（武漢博士德生物科技公司）說明書操作。所得樣本用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值并計(jì)算對(duì)應(yīng)樣品濃度。③免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Bax、Bcl-2、Caspase-3（北京中杉金橋生物科技公司）：切片入水，3% H2O2孵育10 min，滴加多克隆抗體，4℃孵育過夜；滴加二抗，37℃孵育20 min，滴加SP，37℃孵育20 min，DAB 顯色。④TUNEL 檢測(cè)細(xì)胞凋亡（美國(guó)Roche 公司）：腦切片入水，3% H2O2孵育10 min，滴加蛋白酶K，37℃消化10 min，加入反應(yīng)混合液，37℃孵育60 min，加入轉(zhuǎn)化劑，37℃孵育30 min，DAB 顯色。用光學(xué)顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，在方差分析有意義的基礎(chǔ)上，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組小鼠大腦皮質(zhì)組織病理學(xué)結(jié)果

S 組與預(yù)處理組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元排列相對(duì)整齊，胞膜完整，胞質(zhì)豐富，核圓形，結(jié)構(gòu)較為清晰；IR組大腦皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)分布不均，有空泡，核固縮溶解或消失。見圖1。

圖1 3 組小鼠大腦皮質(zhì)組織病理學(xué)結(jié)果 （HE ×400）

2.2 3 組小鼠大腦皮質(zhì)TNF-α、IL-1β 含量比較

3 組小鼠大腦皮質(zhì)TNF-α、IL-1β 含量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IR組大腦皮質(zhì)TNF-α 含量與S 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.213，P =0.000），IR 組升高；預(yù)處理組大腦皮質(zhì)TNF-α 含量與IR 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.183，P=0.002），預(yù)處理組降低。IR 組大腦皮質(zhì)IL-1β 含量與S 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.574，P =0.000），IR 組升高；預(yù)處理組大腦皮質(zhì)IL-1β 含量與IR 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.296，P= 0.008），預(yù)處理組降低。見表1。

表1 3 組小鼠大腦皮質(zhì)TNF-α、IL-1β 含量比較 （n =10，pg/ml，±s）

表1 3 組小鼠大腦皮質(zhì)TNF-α、IL-1β 含量比較 （n =10，pg/ml，±s）

注：1）與S 組比較，P ＜0.05；2）與IR 組比較，P ＜0.05

組別 TNF-α IL-1β S 組 5.7±0.8 13.6±1.3 IR 組 12.8±1.51） 28.3±3.61）預(yù)處理組 9.3±1.41）2） 22.7±2.21）2）F 值 49.233 40.985 P 值 0.000 0.000

2.3 3 組小鼠大腦皮質(zhì)Bax、Bcl-2 和Caspase-3表達(dá)比較

3 組小鼠大腦皮質(zhì)Bax、Bcl-2、Caspase-3 表達(dá)比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。IR 組大腦皮質(zhì)Bax 表達(dá)與S 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.061，P=0.000），IR 組升高；預(yù)處理組大腦皮質(zhì)Bax 表達(dá)與IR 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.255，P=0.002），預(yù)處理組降低。IR 組大腦皮質(zhì)Bcl-2 表達(dá)與S 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 13.763，P=0.000），IR 組降低；預(yù)處理組大腦皮質(zhì)Bcl-2 表達(dá)與IR 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.032，P=0.002），預(yù)處理組升高。IR 組大腦皮質(zhì)Caspase-3表達(dá)與S 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.477，P= 0.000），IR 組升高；預(yù)處理組大腦皮質(zhì)Caspase-3 表達(dá)與IR 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.931，P= 0.003），預(yù)處理組降低。見表2和圖2～4。

2.4 3 組小鼠大腦皮質(zhì)TUNEL 陽性表達(dá)數(shù)比較

S 組小鼠大腦皮質(zhì)TUNEL 陽性表達(dá)數(shù)為（5.60± 2.70），IR 組為（30.50±5.93），預(yù)處理組為（13.30±2.24），3 組比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=62.730，P=0.000）。IR 組大腦皮質(zhì)TUNEL 陽性表達(dá)與S 組比較，IR 組升高（t=9.362，P=0.000）；預(yù)處理組大腦皮質(zhì)TUNEL 陽性表達(dá)與IR 組比較，預(yù)處理組降低（t=6.647，P=0.000）。見圖5。

表2 3 組小鼠大腦皮質(zhì)Bax、Bcl-2 和Caspase-3 的 表達(dá)的比較 （n =10，±s）

表2 3 組小鼠大腦皮質(zhì)Bax、Bcl-2 和Caspase-3 的 表達(dá)的比較 （n =10，±s）

注：1）與S 組比較，P ＜0.05；2）與IR 組比較，P ＜0.05

組別 Bax Bcl-2 Caspase-3 S 組 6.3±1.1 23.7±2.7 5.4±0.7 IR 組 19.4±2.21） 7.3±1.11） 17.6±2.51）預(yù)處理組 14.9±1.41）2） 11.5±2.31）2） 13.2±1.11）2）F 值 100.556 104.396 84.711 P 值 0.000 0.000 0.000

圖2 3 組小鼠大腦皮質(zhì)Bax 表達(dá) （×400）

圖3 3 組小鼠大腦皮質(zhì)Bcl-2 表達(dá) （×400）

圖4 3 組小鼠大腦皮質(zhì)Caspase-3 表達(dá) （×400）

圖5 曲古抑菌素A 對(duì)3 組小鼠大腦皮質(zhì)組織細(xì)胞 凋亡的影響（TUNEL×400）

3 討論

腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制尚未研究清楚，可能存在的機(jī)制包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、細(xì)胞凋亡、興奮性氨基酸毒性、免疫調(diào)控、血腦屏障被破壞，以及神經(jīng)血管單元的相互作用等[4]，但是相關(guān)保護(hù)性機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[4，10]。腦缺血再灌注損傷早中期主要表現(xiàn)為自由基的產(chǎn)生、線粒體功能障礙、炎癥反應(yīng)增強(qiáng)、神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡等，后期則以膠質(zhì)細(xì)胞增殖及小膠質(zhì)細(xì)胞活化促進(jìn)神經(jīng)再生、血管新生等表現(xiàn)為主[4，11]。而臨床發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷主要是急早性期損傷，本研究側(cè)重于研究腦缺血再灌注損傷早期中炎癥反應(yīng)調(diào)控和神經(jīng)元凋亡預(yù)防，對(duì)探討早期腦缺血缺氧性損傷早期保護(hù)及恢復(fù)具有重要意義。

新近研究表明，腦缺血再灌注損傷可使損傷區(qū)神經(jīng)細(xì)胞基因表達(dá)異常[7]，而HDACi 可通過調(diào)節(jié)損傷的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)組蛋白和非組蛋白的修飾，進(jìn)而參與腦缺血再灌注損傷機(jī)制中的多個(gè)環(huán)節(jié)，減輕腦組織損傷并促進(jìn)缺血區(qū)血運(yùn)重建，加快缺血后神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能可塑性的恢復(fù)[7，12-13]。因而本研究選用曲古抑菌素A 預(yù)處理，再行大腦中動(dòng)脈線栓1 h，再灌注24 h，行HE染色發(fā)現(xiàn)早期腦缺血再灌注損傷后大腦皮層神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則，胞質(zhì)分布不均，有空泡，核固縮溶解或消失清晰整齊，表明大腦皮層腦缺血再灌注損傷已經(jīng)形成，而使用曲古抑菌素A 預(yù)處理后再行MACO，大腦皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)與正常對(duì)照組基本一致，表明曲古抑菌素A 預(yù)處理可以改善早期大腦皮質(zhì)缺血再灌注損傷對(duì)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響。

HDACi 大腦皮質(zhì)早期缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制是什么呢？本研究從炎癥反應(yīng)和凋亡機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，曲古抑菌素A 預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)大腦皮質(zhì)早期缺血再灌注損傷后TNF-α、IL-1β 和Bax、Caspase-3 的高表達(dá)及Bcl-2 的低表達(dá)，使之趨向正常表達(dá)水平，并使IR導(dǎo)致的TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)目減少，表明曲古抑菌素A預(yù)處理可通過調(diào)控大腦皮質(zhì)炎癥反應(yīng)和凋亡因子活化來產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)。早期研究表明，腦缺血再灌注損傷可導(dǎo)致神經(jīng)元的染色體啟動(dòng)封閉狀態(tài)，而HDACi 可以糾正神經(jīng)元染色體轉(zhuǎn)變成開放狀態(tài)，起到神經(jīng)保護(hù)的作用[12]。其機(jī)制包括：參與小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的極化調(diào)控，減輕神經(jīng)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，抑制神經(jīng)元凋亡因子活化，促進(jìn)神經(jīng)血管再生等[9-10，12]，而本研究也從神經(jīng)炎癥反應(yīng)和抑制神經(jīng)元凋亡方面進(jìn)行驗(yàn)證。

膠質(zhì)細(xì)胞中的小膠質(zhì)細(xì)胞可敏感察覺大腦組織的微環(huán)境改變，參與免疫監(jiān)視和防御的功能[5-6]。正常狀態(tài)下，小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，當(dāng)在外源性或內(nèi)源性刺激的作用下，其迅速活化，產(chǎn)生并釋放促炎因子如：TNF-α 和IL-1β，并通過交互作用誘導(dǎo)凋亡因子的釋放。而本研究證實(shí)：小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的TNF-α、IL-1β 參與腦缺血再灌注損傷的進(jìn)展，并誘導(dǎo)凋亡因子Bax、Caspase-3 活化水平增加，當(dāng)行曲古抑菌素A預(yù)處理后，炎癥因子TNF-α、IL-1β 表達(dá)降低，凋亡因子Bax、Caspase-3 活化水平下降，Bcl-2 活化增加。這表明小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)大腦正常功能的維持至關(guān)重要，在抗炎癥反應(yīng)和清除凋亡的神經(jīng)元過程中起重要作用，是腦防御的重要機(jī)制[14-16]。

綜上所述，曲古抑菌素A 預(yù)處理通過抑制皮質(zhì)炎癥因子、凋亡因子的表達(dá)及減少細(xì)胞凋亡，減輕大腦皮質(zhì)缺血再灌注損傷。