祝 琴，范文勇，杜麗艷

(深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 深圳 518101)

在正常情況下，女性陰道呈酸性環(huán)境，宮頸有黏液栓，構(gòu)成生理屏障，可抵御細(xì)菌的侵入。但在特殊情況下，如經(jīng)期、分娩、流產(chǎn)后及各種宮腔操作時，屏障作用減弱甚至消失，易發(fā)生細(xì)菌侵入，引起子宮內(nèi)膜炎。急性子宮內(nèi)膜炎可進(jìn)一步發(fā)展為子宮肌炎、輸卵管炎及盆腔炎，導(dǎo)致病情加重。子宮炎癥的治療主要以抗菌藥物治療和洗液外用為主，治療手法單一，但效果因人而異?，F(xiàn)存最早的中藥學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》將紅景天列為藥中上品，服用后可輕身益氣，不老延年，無毒多服，久服不傷人；能補(bǔ)腎，理氣養(yǎng)血，主治周身乏力、胸悶等?！段鞑爻Ｓ弥胁菟帯分姓J(rèn)為，紅景天還具有活血止血、清肺止咳、解熱和止帶下的功效[1]。由此可見，紅景天可從“補(bǔ)益”“抗炎”兩方面對子宮內(nèi)膜炎起到修復(fù)和控制的作用。目前，該藥主要用于心血管疾病的治療[2-4]，在婦科疾病中的應(yīng)用鮮有提及，其療效顯著但缺乏相關(guān)實驗數(shù)據(jù)支持，限制了其應(yīng)用范圍。本研究前瞻性探討了紅景天重要提取物紅景天苷對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞內(nèi)毒素(LPS)刺激模擬的子宮內(nèi)膜炎模型細(xì)胞的保護(hù)作用及抗炎作用，現(xiàn)報告如下。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞株(南方醫(yī)科大學(xué)實驗室提供)。

1.2 藥品與試劑

紅景天苷(美國Sigma公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS，美國Corning公司)，胰蛋白酶(美國Corning公司)，細(xì)胞角蛋白(CK)，抗體(美國Abcam公司)，聚乙二醇辛基苯基醚(Tritonx-100，北京Solarbio公司)，LPS(美國Sigma公司)。

1.3 試劑盒與儀器

噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒(上海伯奧生物制品公司)，酶聯(lián)免疫(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(美國RB公司)，1640培養(yǎng)基(美國RPM公司)，力康HeaLForceB2型生物安全柜(上海力新儀器有限公司)，HeaL Force HF90 CO2型培養(yǎng)箱(上海力新儀器有限公司)，96 孔培養(yǎng)板(美國Costar公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

提前30 min高壓滅菌相關(guān)器械，如玻璃皿、剪刀和鑷子等；移液器及吸頭采用紫外線照射30 min消毒。將子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞株采用PBS組織液清洗3遍，加入10%胎牛血清培養(yǎng)液2 ml，剪碎至1 mm3大小，成糊狀，800 r/min離心5 min；加入PBS漂洗1遍，離心5 min；加入組織量為2～3倍的復(fù)合酶，于37 ℃環(huán)境下消化，每15 min終止1次，加入等量的胎牛血清培養(yǎng)液終止；混合液采用80目篩網(wǎng)過濾，濾去大塊組織，濾液離心600 r/min，重復(fù)離心2～3次，收集沉淀，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中于37 ℃、5%飽和濕度的5% CO2型培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h；將生長良好的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞采用0.25%的胰蛋白酶消化4～5 min后，將懸浮在培養(yǎng)壁上的細(xì)胞輕輕吹打，使其成為懸浮液；去除仍舊貼于培養(yǎng)壁的細(xì)胞及懸液，700 r/min離心5 min，按105個/ml接種于96孔培養(yǎng)板中。

2.2 LPS的制備

將LPS溶液1 ml充分震蕩溶解，采用0.22 μm濾膜正壓過濾除菌分裝，以質(zhì)量濃度為1 mg/ml的LPS作為母液，采用1640培養(yǎng)基稀釋，稀釋比例為1 ∶ 1 000，最終質(zhì)量濃度為1 μg/ml。

2.3 LPS激活內(nèi)膜上皮細(xì)胞

96孔培養(yǎng)板中，每孔先加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基60 μl，然后接種細(xì)胞懸液100 μl，分為空白對照組，正常對照組，紅景天苷低(1×10-9mol/L)、中(1×10-6mol/L)及高(1×10-3mol/L)劑量組，每組設(shè)8個復(fù)孔。37 ℃培養(yǎng)過夜后，空白對照組各孔給予PBS 20 μl；其他組各孔給予25 μg/ml的LPS 20 μl，空白對照組和正常對照組各孔給予1640培養(yǎng)基20 μl對照研究，紅景天苷組各孔給予紅景天苷20 μl處理。

2.4 增殖水平檢測

LPS激活內(nèi)膜上皮細(xì)胞后，靜置24、48 h，棄去舊培養(yǎng)基，添加5 mg/ml的MTT 10 μl繼續(xù)培養(yǎng)，每孔內(nèi)加入二甲基亞砜200 μl，低速震蕩5 min，待結(jié)晶物溶解后于酶標(biāo)儀上以570 nm檢測培養(yǎng)孔的吸光度。

2.5 炎性因子水平檢測

采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)定量測定白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)，于LPS激活內(nèi)膜上皮細(xì)胞24、48 h后取培養(yǎng)基懸浮液1 ml，4 ℃下2 500 r/min離心10 min，取上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-6、IL-1β及TNF-α水平。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖水平

24、48 h后，紅景天苷低、中及高劑量組的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖水平明顯高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且紅景天苷劑量越高，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖水平越高，見表1。

表1 五組子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖水平比較Tab 1 Comparison of proliferation of endometrial epithelium

注：與空白對照組比較，①P<0.05；與紅景天苷低劑量組比較，②P<0.05；與紅景天苷中劑量組比較，③P<0.05；與正常對照組相比，④P<0.05

Note: vs. blank control group,①P<0.05; vs. low-dose group,②P<0.05; vs. medium-dose group,③P<0.05; vs. normal control group,④P<0.05

3.2 紅景天苷對LPS誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分泌IL-6、IL-1β及TNF-α影響

24、48 h后，正常對照組，紅景天苷低、中及高劑量組的IL-6、IL-1β及TNF-α水平明顯高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且紅景天苷劑量越高，IL-6、IL-1β及TNF-α水平越低，見表2。

表2 紅景天苷對LPS誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分泌炎性因子水平影響Tab 2 Effects of salidroside on the secretion of inflammatory factors in LPS-induced endometrial epithelial

注：與空白對照組比較，①P<0.05；與紅景天苷低劑量組比較，②P<0.05；與紅景天苷中劑量組比較，③P<0.05；與正常對照組比較，④P<0.05

Note: vs. blank control group,①P<0.05; vs. low-dose group,②P<0.05; vs. medium-dose group,③P<0.05; vs. normal control group,④P<0.05

4 討論

紅景天的提取物包含紅景天苷、苷元酪醇、絡(luò)塞維、黃酮及其苷類化合物和萜及其苷類化合物，其中對紅景天苷的研究最多，近年來紅景天苷被廣泛應(yīng)用于抗衰老、抗腫瘤、心腦血管疾病及中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)的輔助治療[5-8]。本研究通過LPS誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞建立模型。適當(dāng)濃度的LPS可刺激細(xì)胞增殖，且LPS刺激細(xì)胞增殖活性與LPS刺激時間有關(guān)。劉瑜等[9]采用LPS刺激牙齦成纖細(xì)胞，采用MMT法觀察牙齦成纖細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示，低質(zhì)量濃度的LPS(0.1～1.0 μg/ml)可刺激牙齦成纖細(xì)胞增殖，LPS刺激細(xì)胞增殖可能與其影響細(xì)胞內(nèi)外Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運有關(guān)，亦可能直接激活細(xì)胞內(nèi)其他信號，如細(xì)胞因子、NO等生物活性因子，再由上述生物活性因子間接刺激引發(fā)細(xì)胞增殖。但隨著時間的延長，細(xì)胞對LPS刺激的耐受性下降，能量產(chǎn)生障礙，酶分泌增加，導(dǎo)致細(xì)胞溶解破壞，可表現(xiàn)為細(xì)胞毒性作用，細(xì)胞活性下降，細(xì)胞增殖水平逐漸下降。高質(zhì)量濃度的LPS(>10.0 μg/ml)可經(jīng)抑制細(xì)胞DNA合成或轉(zhuǎn)錄RNA等途徑，抑制細(xì)胞增殖。本研究采用1.0 μg/ml的LPS應(yīng)用于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，正常對照組24、48 h的細(xì)胞活性顯著高于空白對照組，與既往LPS刺激細(xì)胞增殖結(jié)果類似。本研究結(jié)果顯示，24、48 h后，紅景天苷低、中及高劑量組的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖水平明顯高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且紅景天苷劑量越高，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖水平越高。表明紅景天苷具有細(xì)胞保護(hù)作用，且有濃度效應(yīng)。但紅景天苷細(xì)胞保護(hù)作用的確切機(jī)制尚未明確，可能與上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α mRNA表達(dá)，抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3活性等有關(guān)[10-11]。

TNF-α、IL-1β和IL-6是目前公認(rèn)的參與LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)。本研究采用LPS刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞造成細(xì)胞快速增增，并采用ELISA法檢測LPS刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞24、48 h的炎性因子水平。結(jié)果顯示，24、48 h后，正常對照組，紅景天苷低、中及高劑量組的IL-6、IL-1β及TNF-α水平明顯高于空白對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且紅景天苷劑量越高，IL-6、IL-1β及TNF-α水平越低。表明LPS誘導(dǎo)后可引發(fā)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的IL-6、IL-1β和TNF-α分泌增加，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)；紅景天苷可發(fā)揮抗炎作用，且劑量越高，抗炎效果越明顯?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果證實，紅景天苷的抗多種器官纖維化、抗炎作用的機(jī)制為調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子β1的表達(dá)[3，12]。相關(guān)研究探討了紅景天苷對LPS誘導(dǎo)的膿毒血癥大鼠心肌的保護(hù)作用及機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS可顯著降低大鼠心臟細(xì)胞的肌酸激酶、乳酸脫氫酶、TNF-α、IL-α、IL-1β及丙二醛濃度，直接減輕重要器官組織的病變程度、炎性細(xì)胞浸潤及組織細(xì)胞破壞程度[13]。張載潛等[14]采用高糖誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞，加入紅景天苷，發(fā)現(xiàn)紅景天苷能明顯減弱高糖誘導(dǎo)的α-平滑肌肌動蛋白、膠原Ⅰ/Ⅲ型表達(dá)上調(diào)，恢復(fù)高糖誘導(dǎo)的E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)，抑制膠原形成，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)。

綜上所述，本研究采用LPS刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，模擬子宮內(nèi)膜炎癥模型，從細(xì)胞水平觀察紅景天苷是否具有細(xì)胞保護(hù)及抗炎作用。結(jié)果表明，紅景天苷可保護(hù)炎癥反應(yīng)下的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，顯著減輕炎癥反應(yīng)。但紅景天苷如何改善炎癥反應(yīng)，有待于進(jìn)一步研究。