申娜娜， 宮德正， 鄒豐鍇， 嚴(yán) 宇， 關(guān)莉莉， 鄒 原

(大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室， 遼寧 大連 116044)

肥胖呈逐年上升趨勢(shì)，與肥胖密切相關(guān)的代謝性疾病如2型糖尿病、高血壓、心腦血管病、腫瘤等成為全球性公共健康問題，預(yù)防和治療肥胖具有重要的意義[1]。已知脂肪組織可分為白色脂肪組織和棕色脂肪組織。白色脂肪組織主要功能是將能量以三酰甘油的形式儲(chǔ)存于大脂滴中，同時(shí)分泌各種不同的內(nèi)分泌激素(如瘦素，脂聯(lián)素等)來調(diào)節(jié)人體能量平衡[2-3]，白色脂肪組織中的脂肪細(xì)胞在某些因素作用下，可表達(dá)產(chǎn)熱基因，增加能量消耗。這過程稱為“白色脂肪組織棕色化”。棕色脂肪組織主要功能是通過解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein 1，UCP1)介導(dǎo)的解偶聯(lián)作用，減少腺苷三磷酸(ATP)正常產(chǎn)生，將能量以熱能的形式散發(fā)，參與非震顫性產(chǎn)熱和供能，不僅維持體溫平衡，還增加能量消耗，利于抵抗肥胖的形成等，因此促進(jìn)棕色脂肪組織活化及白色脂肪組織棕化是改善肥胖的新策略[4]。

京尼平是中藥梔子的主要成分梔子苷的水解產(chǎn)物。較多研究顯示京尼平有抗炎、抗氧化，治療糖尿病、癌癥以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等作用[5-9]。我們前期研究證明京尼平可改善老齡大鼠胰島素抵抗，降低食源性肥胖大鼠攝食量和體重的作用[7]，但其對(duì)脂肪組織活化和棕化是否有作用，目前尚不清楚。因此，本研究觀察京尼平對(duì)棕色脂肪組織活化和白色脂肪組織棕化的作用，以進(jìn)一步了解京尼平降脂減肥的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

京尼平購(gòu)自Wako公司/日本；TRIzol試劑購(gòu)自天根生化科技有限公司；FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；SuperReal熒光定量預(yù)混試劑(SYBR Green)購(gòu)自天根生化科技有限公司；Western及IP細(xì)胞裂解液購(gòu)自碧云天生化科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天生化科技有限公司；Anti-UCP1抗體購(gòu)自Abacam公司；Anti-β-actin抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔IgG(H+L)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物分組與處理

實(shí)驗(yàn)選用雄性8周齡C57BL/6J小鼠(購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。實(shí)驗(yàn)遵循大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理規(guī)范要求。正常飲食、飲水，小鼠飼養(yǎng)在室溫為22℃±2℃，濕度控制于55%～65%，晝夜時(shí)間均為12 h，適應(yīng)一周之后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、京尼平組和冷刺激組，每組10只。京尼平組小鼠給予腹腔注射京尼平處理(15 mg/(kg·d)，連續(xù)9 d)，對(duì)照組給予生理鹽水處理，冷刺激組小鼠室溫下處理4 d后，置于4℃寒冷環(huán)境中持續(xù)5 d(24 h/d)冷刺激處理。實(shí)驗(yàn)期間，每天監(jiān)測(cè)各組小鼠的體溫、攝食量和體重變化，在實(shí)驗(yàn)的第10日，采集各組小鼠皮下(腹股溝區(qū))、內(nèi)臟(附睪及腎周)的白色脂肪組織及肩胛間區(qū)的棕色脂肪組織，稱量各脂肪組織的濕重，計(jì)算體脂率(脂肪質(zhì)量/體重)，之后將組織經(jīng)液氮速凍后儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆谩Ｈ〖珉蜗聟^(qū)、腹股溝區(qū)及附睪周圍的部分脂肪組織觀察形態(tài)學(xué)的變化，測(cè)定棕色脂肪組織、皮下白色脂肪組織以及內(nèi)臟白色脂肪組織解偶聯(lián)蛋白1(UCP1)的表達(dá)。

1.3 脂肪組織形態(tài)觀察

制片：將肩胛下區(qū)、腹股溝區(qū)及附睪周圍的部分脂肪組織置于10%的福爾馬林液中，用梯度酒精脫水、浸蠟包埋，并通過切片機(jī)將其切成5～6 μm的薄片，烘干備用。HE染色：切片用二甲苯脫蠟，梯度乙醇(無(wú)水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇)脫去二甲苯，加入蘇木精染色，經(jīng)1%鹽酸酒精分化，此時(shí)細(xì)胞核及核糖體成藍(lán)紫色。再加入伊紅染料，細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)淡紅色或者紅色。二甲苯透明，蓋片封片。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR分析

總RNA用TRIzol法提取獲得；cDNA是用2 μg總RNA通過FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(去基因組)方法制備；QPCR用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。UCP1的引物序列：Forward：5’-AGGCTTCCAGTACCATTAGGT-3’，Reverse： 5’-CTGAGTGAGGCAAAGCTGATTT-3’；β-actin的引物序列：Forward：5’-CCTAAGGCCAACCGTGAAAA-3’，Reverse：5’-CAGAGGCATACAGGGACAGCAC-3’。反應(yīng)條件是95℃ 15 min×1, (95℃ 10 s、55℃ 30 s、72℃ 32 s)×40。熒光定量PCR結(jié)果均使用Agilent MX3005 Real Time PCR(美國(guó))擴(kuò)增儀檢測(cè)得出。檢測(cè)結(jié)果用2-△△CT法進(jìn)行分析。

1.5 Western blot

組織剪碎后放入添加了PMSF的Western及IP細(xì)胞裂解液中充分裂解，取上清獲得總蛋白。用BCA法測(cè)定蛋白濃度，采用SDS-PAGE電泳(BIO-RAD)，之后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用TBST配置5%的脫脂奶粉常溫下封閉1 h，清洗膜后在4℃條件下孵育一抗過夜。常溫下孵育二抗1 h。凝膠成像分析系統(tǒng)(BIO-RAD)檢測(cè)膜上目的條帶發(fā)光亮度。ImageJ軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 京尼平對(duì)小鼠體重、攝食量和體溫的影響

京尼平組小鼠的體重、攝食量與對(duì)照組相比無(wú)差異，但體溫在實(shí)驗(yàn)的第8日后與對(duì)照組相比有差異(P<0.05，圖1A、B、C)。冷刺激組小鼠進(jìn)行冷刺激處理后第3日，體重下降，小于常溫條件下的小鼠(圖1A)；攝食量大于常溫下的兩組小鼠，在實(shí)驗(yàn)第7日和第8日(冷刺激后第3日和第4日)時(shí)增加明顯(P<0.01，圖1B)。冷刺激處理可使小鼠體溫顯著下降(P<0.01, 圖1C)。

Fig.1Effects of genipin on body weight, food intake and body temperature of mice(n=10)

A: Body weight; B: Food intake; C: Body temperature. In the first four days, three groups of mice were in the normal temperature environment, and in the later five days, the mice with cold-stimulus were exposed to 4℃ environment

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.2 京尼平對(duì)脂肪組織濕重、體脂率的影響

與對(duì)照組相比，京尼平組棕色脂肪組織的濕重明顯增加(P<0.05，表1)；冷刺激組棕色脂肪組織濕重也有增加，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，表1)。與對(duì)照組相比，京尼平組和冷刺激組白色脂肪組織的濕重明顯減少(P<0.05，表1)，體脂率亦明顯減少(P<0.05，表1)。

GroupWet weight of brown adipose(g)Wet weight of white adipose(g)Body fat rate(%)Control0.045±0.0080.331±0.0441.633±0.159Genipin0.066±0.003*0.277±0.033*1.200±0.113*Cold-stimulus0.058±0.0080.219±0.194*1.133±0.095*

*P<0.05vscontrol group

2.3 京尼平對(duì)脂肪細(xì)胞形態(tài)的影響

與對(duì)照組相比，京尼平組和冷刺激組的棕色脂肪細(xì)胞脂滴變小，數(shù)量增加(圖2A1-A3)。京尼平組的皮下和內(nèi)臟白色脂肪細(xì)胞均出現(xiàn)與冷刺激組相似的變化，與對(duì)照組脂肪細(xì)胞相比，細(xì)胞內(nèi)脂滴變小，數(shù)量增加(圖2B1-B3，C1-C3)。

Fig.2Morphological analysis of adipose tissues after genipin treatment(HE staining ×200)

A1, A2 and A3 represent brown adipocytes of control group, genipin group and cold-stimulus group respectively; B1, B2and B3represent subcutaneous adipocytes of control group, genipin group and cold-stimulus group respectively; C1, C2and C3represent visceral adipocytes of control group, genipin group and cold-stimulus group respectively

2.4 京尼平對(duì)脂肪組織的UCP1 mRNA表達(dá)的影響

棕色脂肪組織中UCP1 mRNA水平在冷刺激組的表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組顯著增加(P<0.01，表2)；京尼平組的UCP1 mRNA水平的表達(dá)量與對(duì)照組相比也有顯著增加(P<0.05, 表2)。皮下脂肪組織中，京尼平組和冷刺激組小鼠UCP1 mRNA水平均顯著升高，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05，表2)。內(nèi)臟脂肪組織中，京尼平組和冷刺激組的UCP1 mRNA水平相對(duì)于對(duì)照組均明顯增加(P<0.05，表2)。

Group2-△△CT (BAT)2-△△CT(SAT)2-△△CT(VAT)Control1.000±0.1841.000±0.0201.000±0.076Genipin2.881±0.455*24.460±7.735*2.041±0.408*Cold-stimulus17.700±1.042**11.720±2.757*3.228±0.225*

BAT: Brown adipose tissue; SAT: Subcutaneous adipose tissue; VAT: Visceral adipose tissue

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.5 京尼平對(duì)脂肪組織的UCP1蛋白表達(dá)的影響

進(jìn)一步觀察京尼平對(duì)脂肪組織UCP1蛋白表達(dá)的作用。結(jié)果顯示，棕色脂肪組織中，京尼平組和冷刺激組UCP1蛋白表達(dá)量，相對(duì)于對(duì)照組均明顯增加(P<0.05, 圖3A)。皮下白色脂肪組織、內(nèi)臟白色脂肪組織中，京尼平和冷刺激處理后，UCP1蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比均明顯增加(P<0.05和P< 0.01, 圖3B，3C)。

Fig.3Genipin upregulates UCP1 protein expression in adipose tissues(n=3)

A: Brown adipose tissue; B: Subcutaneous adipose tissue; C: Visceral adipose tissue

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

3 討論

有研究顯示，在寒冷刺激或者是β3腎上腺素受體激動(dòng)劑的作用下，棕色脂肪細(xì)胞可以被活化，促進(jìn)脂質(zhì)氧化分解，從而產(chǎn)熱增加，起到維持體溫的作用，且伴有體重減少的現(xiàn)象[10-12]。在腎上腺素受體激動(dòng)劑或寒冷刺激下，白色脂肪組織中有部分白色脂肪細(xì)胞可發(fā)生類似棕色脂肪細(xì)胞的形態(tài)變化，脂滴增多，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體數(shù)量增加，且棕色脂肪細(xì)胞標(biāo)志性基因UCP1 mRNA表達(dá)增加，功能上也有類似棕色脂肪細(xì)胞耗能、產(chǎn)熱的作用，這些現(xiàn)象表明白色脂肪細(xì)胞發(fā)生了棕化[13-14]。有文獻(xiàn)證實(shí)，冷刺激處理的前3 d，體溫變化較為明顯，以后趨于平穩(wěn)[15]。因此，本實(shí)驗(yàn)選用寒冷刺激作為陽(yáng)性對(duì)照，并選用5 d作為冷刺激組小鼠冷暴露時(shí)長(zhǎng)，以保證寒冷刺激后小鼠機(jī)體代謝處于穩(wěn)定狀態(tài)，觀察京尼平是否具有與寒冷刺激相類似的促進(jìn)脂肪組織“活化”或“棕化”作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，京尼平處理后小鼠的體溫較對(duì)照組升高，棕色脂肪組織濕重增加，白色脂肪組織濕重以及體脂率下降，京尼平組和冷刺激組小鼠的3種脂肪細(xì)胞出現(xiàn)脂滴變小、數(shù)量增加等相同的形態(tài)變化。這些結(jié)果提示京尼平可促進(jìn)棕色脂肪組織的活化和白色脂肪組織的棕化，增加脂肪的氧化分解，增加熱量的產(chǎn)生與釋放，減少小鼠體內(nèi)脂質(zhì)的蓄積。有研究顯示，黃連素等可促進(jìn)外周脂肪分解代謝，引起脂肪細(xì)胞出現(xiàn)脂滴變小、數(shù)量增加等形態(tài)變化[16-17]。我們的研究顯示京尼平也具有相似的作用。

另外，實(shí)驗(yàn)中也觀察到，京尼平組和冷刺激組小鼠與對(duì)照組相比，棕色脂肪組織的顏色加深，白色脂肪組織的顏色也由白色變?yōu)闇\紅色。脂肪組織的顏色變化與已有的研究結(jié)果一致[15]。同時(shí)也有研究表明在高脂飲食的小鼠中，白色脂肪組織中特異性的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)增加，誘發(fā)白色脂肪組織棕化，增加棕色脂肪組織，從而達(dá)到預(yù)防肥胖和胰島素抵抗的作用，以往的研究可以解釋本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中脂肪組織顏色變化的現(xiàn)象[18-20]。

為進(jìn)一步證實(shí)京尼平促進(jìn)棕化的作用，我們分別從核酸和蛋白水平檢測(cè)棕色脂肪組織“活化”和白色脂肪組織“棕化”的標(biāo)志分子UCP1的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，京尼平組與冷刺激組小鼠UCP1在棕色脂肪組織、皮下白色脂肪組織和內(nèi)臟白色脂肪組織中的表達(dá)均上調(diào)。結(jié)果表明京尼平具有類似冷刺激促進(jìn)棕色脂肪組織活化以及白色脂肪組織棕化的作用。因?yàn)榫┠崞胶屠浯碳な莾煞N不同屬性的刺激因素，因此，難以簡(jiǎn)單比較二者對(duì)脂肪組織的作用效應(yīng)。目前已知冷刺激主要通過交感神經(jīng)和甲狀腺激素，促進(jìn)脂肪組織的活化與棕化，而京尼平如何促進(jìn)脂肪組織的活化與棕化，還需要進(jìn)一步深入研究。此外，我們還觀察到，京尼平刺激皮下白色脂肪組織的UCP1 mRNA表達(dá)作用較棕色脂肪組織和內(nèi)臟脂肪組織更加明顯(表2)，這一現(xiàn)象與以往的研究結(jié)果相一致[15-21]。但是，皮下白色脂肪組織中UCP1蛋白表達(dá)結(jié)果顯示京尼平組沒有冷刺激組明顯(圖3)。這種核酸和蛋白水平上的表達(dá)差異可能由于是轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的作用，具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)京尼平可促進(jìn)UCP1的表達(dá)，促進(jìn)棕色脂肪組織的代謝活性和白色脂肪組織棕化，減少體內(nèi)脂肪的蓄積，從而達(dá)到降脂減肥的目的。該結(jié)果為京尼平在肥胖等代謝性疾病的防治應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。