楊 晨, 宋垚垚, 季一發(fā)

(1. 中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心燒傷整形科， 天津 300162； 2. 解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心燒傷科， 北京 100048； 3. 北京豐臺(tái)右安門(mén)醫(yī)院美容整形科， 北京 100069)

機(jī)體嚴(yán)重燙傷早期，毛細(xì)血管通透性增加使有效循環(huán)血流量相對(duì)不足，微循環(huán)障礙削弱了腸黏膜的屏障功能，由于菌群失調(diào)尤其是條件致病菌的大量擴(kuò)增，腸道內(nèi)細(xì)菌及其產(chǎn)物移至腸外，首先通過(guò)腸淋巴循環(huán)、門(mén)脈系統(tǒng)浸入周?chē)哪c系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟等臟器，其次是細(xì)菌釋放大量的內(nèi)毒素入血后可以引起腸源性內(nèi)毒素血癥，此外腸內(nèi)細(xì)菌及其產(chǎn)物的轉(zhuǎn)移可以造成巨噬細(xì)胞的過(guò)度活化，釋放大量的炎性介質(zhì)，從而引發(fā)腸源性高代謝狀態(tài)[1]。腸黏膜屏障功能的破壞是問(wèn)題的關(guān)鍵[2]，因此，有效的維護(hù)和重建腸黏膜屏障具有重要的臨床意義。研究證實(shí)，參麥注射液可有效防治嚴(yán)重燙傷，但對(duì)嚴(yán)重燙傷后腸黏膜屏障是否有修復(fù)作用未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立嚴(yán)重燙傷大鼠模型，研究參麥注射液對(duì)腸黏膜屏障的保護(hù)作用，旨在為臨床腸粘膜的早期保護(hù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

選用SPF級(jí)，健康 Wistar大鼠,體重 180～200 g，雄性，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，室溫(25±1)℃，明暗交替各12 h，自由飲水取食。參麥注射液由雅安三九藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z51021845。內(nèi)毒素鱟試劑盒(上海市伊華臨床醫(yī)學(xué)科技公司)。雙抗夾心放免測(cè)定試劑盒(邦定公司)?？貢r(shí)控溫控壓蒸汽燙傷儀(南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院燒傷研究所)。

1.2 動(dòng)物分組、給藥

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組(Normal control group)；模型對(duì)照組(Model control group)，燙傷后立即灌胃生理鹽水，每次10 ml/kg，每天1次；地塞米松治療組(Hexadecadrol group)，燙傷后立即腹腔注射地塞米松10 ml/kg，每天1次；參麥注射液治療組，低(Shenmai 5 mg/kg group)、中(Shenmai 10 mg/kg group)、高(Shenmai 15 mg/kg group)劑量組燙傷后立即腹腔注射5、10、15 mg/kg，每天1次。每組動(dòng)物10只，燙傷后72 h麻醉取血、取材。

1.3 動(dòng)物模型的制備

Wistar大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉45 mg/kg進(jìn)行麻醉，固定，背部8%硫化鈉脫毛，脫毛區(qū)用控時(shí)控溫控壓蒸汽燙傷儀造成大鼠30%體表面積Ⅲ°燙傷，燙傷儀參數(shù)：壓力3 MPa、溫度107℃、時(shí)間8 s。各組燙傷后立即灌胃生理鹽水3 ml抗休克，背部傷口用碘伏抗感染，每天1次，燙傷大鼠單籠飼養(yǎng)，對(duì)照組動(dòng)物除不燙傷外，其余操作同燙傷組。

1.4 血漿DAO、TNF-α、IL-6含量測(cè)定

取無(wú)菌操作獲得的血漿，溶解后，3 000 r/min離心10 min，取上清液，采用分光光度法，測(cè)定二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)的含量；采用放射免疫法測(cè)定腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin, IL-6)的含量。

1.5 血漿內(nèi)毒素的測(cè)定

各組動(dòng)物于燙傷后72 h，無(wú)菌操作用一次性無(wú)菌注射器吸取下腔靜脈血1.5 ml，肝素抗凝，1 000 r/min離心10 min，分離血漿，保存于-30℃冰箱。采用試劑盒，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作，采用鱟試劑偶氮基質(zhì)顯色進(jìn)行定量。

1.6 腸粘液sIgA測(cè)定

無(wú)菌操作，剪取空腸回腸中段約10 cm腸管，用剪刀縱行剪開(kāi)，輕輕去除腸內(nèi)容物，用玻片輕輕刮取粘液，收集于1.5 ml離心管中，加入0.01 mol/L PBS(pH 7.4)稀釋，充分混勻后3 000 r/min離心15 min取上清液，采用試劑盒，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作，采用雙抗夾心放免法測(cè)定，同時(shí)碧云天BCA試劑盒測(cè)定總蛋白，計(jì)算每毫克腸粘液中分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin, sIgA)含量。

1.7 大鼠肝臟、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌移位量測(cè)定[3-4]

大鼠腹腔液培養(yǎng)：經(jīng)頸總動(dòng)脈放血處死大鼠，用75%乙醇消毒，在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)用剪刀打開(kāi)腹腔，取1 ml 0.15 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)反復(fù)沖洗腹腔，收集沖洗液，將其中0.1 ml沖洗液接種于LB瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，無(wú)菌分離肝臟、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)，稱重，剪碎，勻漿。

內(nèi)臟組織勻漿細(xì)菌培養(yǎng)：取腹腔沖洗液培養(yǎng)陰性的大鼠肝臟、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)勻漿液 0.1 ml接種于 LB瓊脂培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，計(jì)算每克組織內(nèi)細(xì)菌菌落形成單位數(shù)(colony forming units, CFU)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠燙傷72 h血漿DAO、TNF-α、IL-6含量

與對(duì)照組相比，燙傷后72 h模型組大鼠血漿DAO、TNF-α、IL-6水平明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，各給藥組大鼠血漿DAO、TNF-α、IL-6水平明顯降低(P<0.01，表1)。

2.2 各組大鼠燙傷72 h血漿內(nèi)毒素含量

與對(duì)照組相比，燙傷后72 h模型組大鼠血漿內(nèi)毒素水平明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，各給藥組大鼠血漿內(nèi)毒素水平明顯降低(P<0.01，表2)。

2.3 各組大鼠燙傷72 h腸粘液sIgA含量

與對(duì)照組相比，燙傷后72 h模型組大鼠腸粘液sIgA水平明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，各給藥組大鼠腸粘液sIgA水平明顯降低(P<0.01，表2)。

GroupDAO(U/ml)TNF-α(ng/ml)IL-6(ng/L)Normal control0.06±0.020.20±0.0680.3±11.8Model control0.94±0.17**3.52±1.15**337.3±29.5**Hexadecadrol0.73±0.15##2.35±0.39##272.6±42.5##Shen-mai 5 mg/kg0.79±0.12#2.48±0.60#291.4±44.1#Shen-mai 10 mg/kg0.70±0.17##△2.40±0.53#304.8±38.9#Shen-mai 15 mg/kg0.64±0.13##2.32±0.41##259.4±46.3##▲

DAO: Diamine oxidase; TNF-α: Tumor necrosis factor-α; IL-6: Interleukins-6

*P<0.05,**P<0.01vsnormal control group;#P<0.01,

##P<0.01vsmodel control group;△P<0.05vsShenmai 5 mg/kg group;▲P<0.05vsShenmai 10 mg/kg group

GroupEndotoxin(Eu/L)sIgA(μg/g)Normal control1191.3±236.884.9±14.1Model control7156.1±1806.7**60.8±9.6**Hexadecadrol3312.2±1105.8##75.5±11.8##Shen-mai 5 mg/kg4005.5±988.8##72.1±11.7#Shen-mai 10 mg/kg3250.1±1459.0##76.1±8.7##Shen-mai 15 mg/kg2746.3±1076.7##△75.4±10.0##

*P<0.05,**P<0.01vsnormal control group;#P<0.01,

##P<0.01vsmodel control group;△P<0.05vsShenmai 5 mg/kg group

2.4 各組大鼠燙傷后肝、脾、腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌移位量

除對(duì)照組外，模型組和各給藥組肝、脾、腸系膜淋巴結(jié)組織細(xì)菌培養(yǎng)均有菌落形成。各給藥組肝、脾、腸系膜淋巴結(jié)組織細(xì)菌移位量明顯低于燙傷組(P<0.01，表3)。

Group Liver SpleenMesenteric lymph nodesNormal control 0±0 0±0 0±0Model control189.8±33.2**360.8±161.1**933.2±241.8**Hexadecadrol87.9±26.2##130.5±30.3#514.3±164.8#Shen-mai 5 mg/kg147.2±22.2##ΔΔ238.9±87.3##ΔΔ669.0±221.4##Shen-mai 10 mg/kg139.5±26.3##ΔΔ156.4±54.7##▲576.2±212.7##Shen-mai 15 mg/kg107.9±21.6##▲▲○○133.2±41.9##▲▲500.4±230.9##

CFU: Colony-forming units

*P<0.05,**P<0.01vsnormal control group;#P<0.01,

##P<0.01vsmodel control group;ΔΔP<0.01vshexadecadrol group;▲P<0.05,▲▲P<0.01vsShenmai 5 mg/kg group;○○P<0.01vsShenmai 10 mg/kg group

3 討論

胃腸道血流豐富，最易受到缺血缺氧的損害。正常情況下，胃腸屏障保護(hù)胃腸道免受腸腔內(nèi)細(xì)菌及其內(nèi)毒素的侵害。嚴(yán)重燙傷后，由于創(chuàng)傷應(yīng)激狀態(tài)，往往破壞腸上皮細(xì)胞之間的緊密連接，導(dǎo)致腸粘膜屏障功能削弱，腸粘膜通透性立即增高，從而使腸道細(xì)菌和蓄積的內(nèi)毒素得以侵入體內(nèi)形成菌血癥和內(nèi)毒素血癥，重者導(dǎo)致全身播散，循環(huán)中的內(nèi)毒素又可反饋性地促進(jìn)腸道中細(xì)菌和內(nèi)毒素持續(xù)入血，形成一惡性循環(huán)[5-6]。如何防治嚴(yán)重燙傷后細(xì)菌易位和內(nèi)毒素入血是廣大臨床醫(yī)生極為關(guān)注的問(wèn)題。

腸道菌群之間相互協(xié)同、拮抗，并與腸黏膜粘附結(jié)合形成生物屏障，阻礙致病菌對(duì)機(jī)體的侵襲。燙傷后，生物屏障功能減弱，大腸埃希菌等機(jī)會(huì)致病菌過(guò)度生長(zhǎng)并穿過(guò)生物屏障侵入血液、淋巴[7]。本研究中給予參麥注射液治療組能夠顯著降低組織細(xì)菌移位量和血液細(xì)菌內(nèi)毒素水平。

二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)是一種具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，存在于哺乳動(dòng)物腸黏膜上層絨毛細(xì)胞胞漿中。DAO在外周血中活性穩(wěn)定，能夠反映腸上皮細(xì)胞的完整性以及腸黏膜屏障的功能狀態(tài)。降低膿毒癥大鼠腸組織血液TNF-α、IL-6等含量，可顯著減輕膿毒癥大鼠腸黏膜損傷[8]。本實(shí)驗(yàn)中，燙傷72 h后，大鼠發(fā)生腸黏膜屏障受損、炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，參麥注射液治療，可降低機(jī)體的炎癥反應(yīng)，改善燙傷后腸黏膜屏障功能，增加機(jī)體抗打擊和促進(jìn)恢復(fù)的功能。

腸粘膜表面粘液層具有重要的生理屏障作用，粘液中的糖蛋白和sIgA相互配合，將sIgA包被的細(xì)菌牢固限于粘液層中，并隨粘液層的更新和流動(dòng)將包被的有害菌排除體外。燙傷的機(jī)體免疫功能受損，sIgA分泌減少，外襲菌易于粘附定植，誘發(fā)細(xì)菌移位(bacterial translocation, BT)的發(fā)生，甚至造成全身播散性感染[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠燙傷后72 h即有腸粘液局部體液免疫功能降低，參麥注射液可改善腸道免疫功能，其機(jī)制可能與刺激漿細(xì)胞分泌sIgA水平，從而降低腸道細(xì)菌移位量，減少腸源性感染的發(fā)生。