王艾云

天津市北辰區(qū)中醫(yī)醫(yī)院 300400

下肢血管病變(Vascular disease of lower extremity，VDLE)是T2DM患者較為常見的一種合并癥，往往會(huì)引起肢端壞疽癥狀的發(fā)生，對(duì)患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生較大的影響。目前，臨床上關(guān)于T2DM合并VDLE的發(fā)病機(jī)制尚未完全明晰。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道稱[1]：該病可能是與機(jī)體免疫功能異常存在一定的關(guān)聯(lián)性，屬于一種因自身免疫系統(tǒng)紊亂而導(dǎo)致的一種炎性反應(yīng)。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷時(shí)，機(jī)體相關(guān)炎性因子如IL-6的表達(dá)水平以及活性顯著增高。IL-6是介導(dǎo)免疫反應(yīng)以及炎性反應(yīng)的一種十分重要的遞質(zhì)，可引起多種細(xì)胞發(fā)生增殖反應(yīng)。而遺傳因子如啟動(dòng)子基因的多態(tài)性能夠顯著提高IL-6的表達(dá)水平以及活性，可能是T2DM合并VDLE發(fā)病的一個(gè)十分重要的影響因素[2]。本研究主要探討了IL-6啟動(dòng)子-572C/G和-597G/A基因多態(tài)性與T2DM合并VDLE發(fā)病之間的相關(guān)關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年8月—2018年8月于我院接受診療的190例T2DM患者作為觀察對(duì)象，均為漢族患者，且相互之間無親緣或者血緣關(guān)系。男女比例為90∶100；年齡為43～69歲，平均年齡(57.29±6.56)歲；BMI范圍為20～28，平均BMI 24.38±2.12。VDLE診斷標(biāo)準(zhǔn)為：經(jīng)血管彩色多普勒超聲診斷，動(dòng)脈內(nèi)膜厚度增加在1mm以上，血管管壁欠光滑或者粗糙，存在血管管腔狹窄或者閉塞。將本組入選對(duì)象分為合并VDLE組(n=99)與未合并VDLE組(n=91)。另外選擇同期于我院參加體檢的85名健康者作為對(duì)照組。上述3組入選對(duì)象在性別及年齡方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取方法:上述3組入選對(duì)象均于晨起空腹?fàn)顟B(tài)下抽取肘靜脈血3.0ml，采用EDTA進(jìn)行抗凝，于-80℃的冰箱中進(jìn)行保存，將外周血基因組DNA進(jìn)行提取，采用分光光度儀對(duì)光度值進(jìn)行測(cè)定，據(jù)此對(duì)DNA純度以及濃度水平進(jìn)行計(jì)算。

1.2.2 基因分析方法:將限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)方法(Restriction fragment length polymorphism polymerase chain reaction，PCR-RFLP)對(duì)IL-6啟動(dòng)子區(qū)-572C/G與-597G/A基因多態(tài)性進(jìn)行測(cè)定分析。引物序列見表1。

表1IL-6啟動(dòng)子區(qū)-572C/G與-597G/A基因多態(tài)性引物序列

PCR反應(yīng)體系：采用體積為2.5μl的10×PCR緩沖液，4.0μl的濃度為10mmol/L的dNTP，取上、下游引物各為1.0μl，1.0μl的模板DNA，0.2μl的濃度為5U/μl的Taq DNA酶，然后加水至25μl。具體條件為：94℃溫度條件下預(yù)變性時(shí)間為5min，變性時(shí)間為40s，58℃退火時(shí)間為1min，35次循環(huán)之后72℃條件下延伸5min。PCR產(chǎn)物采用質(zhì)量水平為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定之后，采取限制性內(nèi)切酶BsrB I于37℃條件下消化約120min，再使用濃度為2%的TBE瓊脂糖進(jìn)行電泳試驗(yàn)(見圖1、2)，采用紫外凝膠成像分析儀對(duì)上述PCR結(jié)果進(jìn)行仔細(xì)觀察。

圖1IL-6啟動(dòng)子-572C/G的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果示意圖

注：1、2、3、4道分別代表DL2000 DNA標(biāo)記物、基因型C/C、G/C以及G/G。

1.3 觀察指標(biāo) 比較合并VDLE組、未合并VDLE組以及對(duì)照組IL-6啟動(dòng)子-572C/G與-597G/A的基因型及等位基因頻率分布情況；IL-6啟動(dòng)子-572C/G與-597G/A基因電泳試驗(yàn)結(jié)果。

圖2IL-6啟動(dòng)子-597G/A的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果示意圖

注：1、2、3、4道分別代表DL2000 DNA標(biāo)記物、基因型G/G、G/A以及A/A。

2 結(jié)果

2.1 3組入選對(duì)象IL-6啟動(dòng)子-572C/G的基因型及等位基因頻率分布情況對(duì)比 合并VDLE組CG、GG、G頻率均顯著高于未合并VDLE組與對(duì)照組(P均<0.05)，見表2。

表23組入選對(duì)象IL-6啟動(dòng)子-572C/G的基因型及等位基因頻率分布情況比較[n(%)]

注：aP<0.05，VS對(duì)照組；bP<0.05，VS未合并VDLE組。

2.2 3組入選對(duì)象IL-6啟動(dòng)子-597G/A的基因型及等位基因頻率分布情況對(duì)比 合并VDLE組GA、AA、A頻率均顯著低于未合并VDLE組與對(duì)照組(P均<0.05)，見表3。

表33組入選對(duì)象IL-6啟動(dòng)子-597G/A的基因型及等位基因頻率分布情況比較[n(%)]

注：aP<0.05，VS對(duì)照組；bP<0.05，VS未合并VDLE組。

3 討論

相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道稱：自身免疫性炎癥與T2DM大血管病變存在密切的關(guān)聯(lián)性，也有學(xué)者認(rèn)為[3]：糖尿病及其大血管合并癥是自身免疫所介導(dǎo)的炎性疾病。某些重要的炎性因子及其免疫標(biāo)志物，如IL-6等因子均可能與糖尿病大血管合并癥存在緊密的關(guān)聯(lián)性。IL-6屬于一種功能多元化的細(xì)胞因子，其在免疫系統(tǒng)、造血系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)之中均存在著十分重要作用，該指標(biāo)水平上升也是導(dǎo)致糖尿病發(fā)病的一個(gè)高危因素。當(dāng)前，臨床上關(guān)于IL-6與糖尿病大血管病變的研究主要集中于心腦血管病變方面，而IL-6與T2DM合并VDLE之間的相關(guān)關(guān)系方面的研究則非常少。相關(guān)文獻(xiàn)資料報(bào)道稱[4-5]：IL-6啟動(dòng)子-572C/G與-597G/A基因多態(tài)性與動(dòng)脈阻塞性肺疾病呈現(xiàn)出明顯關(guān)聯(lián)性。雖然T2DM合并VDLE的發(fā)病機(jī)理與粥樣硬化性病變比較接近，然而其機(jī)制更加復(fù)雜。因此，探討IL-6啟動(dòng)子-572C/G與-597G/A基因多態(tài)性與T2DM合并VDLE之間相關(guān)關(guān)系，具有較高臨床價(jià)值。

本文結(jié)果顯示：合并VDLE組CG、GG、G頻率均顯著高于未合并VDLE組與對(duì)照組(P均<0.05)，合并VDLE組GA、AA、A頻率均顯著低于未合并VDLE組與對(duì)照組(P均<0.05)。出現(xiàn)上述結(jié)果，主要原因在于：IL-6作為一個(gè)常見的炎性因子，它在基因水平的單核苷酸多態(tài)性與T2DM合并VDLE提供全新的治療對(duì)策。上述結(jié)果提示：基于傳統(tǒng)治療，還應(yīng)該開展相應(yīng)的抗炎以及抗免疫治療。隨著臨床上對(duì)糖尿病地不斷深化認(rèn)識(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)血糖水平控制理想并不能減少或延緩合并癥的出現(xiàn)，特別是大血管合并癥。而越來越多的證據(jù)顯示：自身免疫功能紊亂以及長期的慢性炎癥在糖尿病及其合并癥的進(jìn)展過程中扮演著非常重要的角色。從免疫學(xué)的角度來探討糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制，是今后研究的一個(gè)重點(diǎn)方向和焦點(diǎn)。

綜上所述，IL-6啟動(dòng)子-572C/G和-597G/A基因多態(tài)性與T2DM合并VDLE發(fā)病之間存在緊密的相關(guān)性，可能參與T2DM及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程。