呂 芳 葉之慧

佳木斯大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，黑龍江省佳木斯市 154007

齲白斑是一種常見于固定正畸治療的并發(fā)癥，大約有一半的患者會(huì)發(fā)生齲白斑，變形鏈球菌是口腔中的常居菌群，也被認(rèn)為是一種重要的致齲菌[1]，因此，理想的正畸粘結(jié)劑必須抑制或減少細(xì)菌的生長。與其他抗菌劑相比，季銨鹽是一類具有優(yōu)良抗菌性的化合物，它還有滲透性強(qiáng)、性能穩(wěn)定，對皮膚有輕微刺激、低毒、低腐蝕和長效生物學(xué)等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)和制藥業(yè)等領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用[2-3]。在本實(shí)驗(yàn)中，將季銨鹽單體加入到正畸釉質(zhì)粘結(jié)劑中以觀察其是否能抑制變形鏈球菌，對正畸粘結(jié)劑本身的粘結(jié)強(qiáng)度是否有影響，以此證明其是否具有臨床應(yīng)用意義，為日后改善抗菌齒科粘結(jié)材料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株與主要試劑 季銨鹽(深圳市金騰龍實(shí)業(yè)有限公司)，變形鏈球菌(Streptococcus mutans，S．m),ATCC25175(購買自上海瑞楚生物科技有限公司)，培養(yǎng)基為腦心浸液肉湯(BHI)培養(yǎng)基，京津釉質(zhì)粘結(jié)劑，75%乙醇溶液，無菌生理鹽水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 變形鏈球菌的培養(yǎng)：變形鏈球菌常規(guī)復(fù)蘇，鑒定為純培養(yǎng)后，取單個(gè)菌落置于BHI 肉湯中并在37℃的厭氧環(huán)境下培養(yǎng)直至使用。

1.2.2 正畸粘結(jié)劑樣本的制備：用球磨法將季銨鹽型抗菌單體和正畸托槽粘結(jié)劑作如下處理，分別以1∶99，2∶98，3∶97，4∶96和5∶95(g)的重量比混合，分別命名為SYZ1、SYZ2、SYZ3、SYZ4和SYZ5，然后在干燥相對封閉的操作箱內(nèi)將兩者的混合體在瑪瑙研缽內(nèi)研磨以實(shí)現(xiàn)兩種材料的均勻混合。因此，含抗菌單體的正畸粘結(jié)劑含抗菌劑的濃度為：1%、2%、3%、4%、5%(w/w%)。

1.2.3 最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定：向含有8ml BHI培養(yǎng)液的15只試管中分別加入用BHI培養(yǎng)液配制的季銨鹽型單體溶液(100g/ml、200g/ml、300g/ml、400g/ml、500g/ml)各1.0ml，然后向各試管中加入1.0ml的變形鏈球菌菌懸液，濃度為1×106CFU/ml(血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù))，使季銨鹽型抗菌單體的終濃度分別為10g/ml、20g/ml、30g/ml、40g/ml、50g/ml。將所有試管置于搖床中振蕩培養(yǎng)2h。取每瓶培養(yǎng)液1.0ml，10倍系列稀釋至10-3后涂布于BHI瓊脂平板上0.1ml，置于恒溫培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24h，計(jì)數(shù)菌落數(shù)，存活菌數(shù)與添加的菌數(shù)相近的最低濃度即為季銨鹽型抗菌單體的最低抑菌濃度(MIC)。按季銨鹽型抗菌單體的終濃度分別為30g/ml、35g/ml、40g/ml、45g/ml、50g/ml設(shè)5個(gè)試驗(yàn)組，具體方法同MIC操作步驟，計(jì)數(shù)菌落數(shù)后，平皿中不長菌或平均菌落數(shù)<3個(gè)的最低濃度即為季銨鹽型單體最低殺菌濃度(MBC)。同時(shí)，將未加季銨鹽型單體的溶液作為對照組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)樣品，并重復(fù)測定MBC和MIC 3次。

1.2.4 抗菌性能檢測：使用相同的標(biāo)準(zhǔn)模具將SYZ1、SYZ2、SYZ3、SYZ4、SYZ5和空白對照組制成厚度為2mm的30mm×30mm試驗(yàn)樣品。所有樣品在測試前用75%乙醇溶液擦拭，用無菌鹽水反復(fù)洗滌，在超凈工作臺(tái)上自然干燥以備后用。取0.2ml的變形鏈球菌液(連續(xù)轉(zhuǎn)接2次，用無菌鹽水稀釋至約1×107CFU/ml的菌液)分別滴加到空白對照試驗(yàn)片和試驗(yàn)片上。用無菌鑷子將薄膜覆蓋于樣品上，將菌液與樣品均勻接觸，然后置于無菌培養(yǎng)皿中，并在厭氧環(huán)境下培養(yǎng)24h。加入20ml 生理鹽水，反復(fù)洗滌，充分搖勻，將變形鏈球菌洗脫液10倍系列稀釋至10-3，在平板培養(yǎng)基上接種0.1ml，37℃下培養(yǎng)24h后菌落計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定：抗菌率R% = (A-B)/A×100%，A：空白對照樣品平均回收菌數(shù) (CFU/片)，B：抗菌樣品平均回收菌數(shù)(CFU/片)。

1.2.5 抗剪切性能檢測：選擇因正畸拔除的無齲壞前磨牙60顆，要求拔除半年內(nèi)，非四環(huán)素牙，非氟斑牙，肉眼觀察牙釉質(zhì)無裂縫及缺損，隨機(jī)分為6組，每組10顆，分別標(biāo)記為A、B、C、D、E、F組 (A組：未添加季銨鹽型單體的正畸托槽粘結(jié)劑組；B組：添加1%季銨鹽型單體的正畸托槽粘結(jié)劑組；C組：添加2%季銨鹽型單體的正畸托槽粘結(jié)劑組；D組：添加3%季銨鹽型單體的正畸托槽粘結(jié)劑組；E組：添加4%季銨鹽型單體的正畸托槽粘結(jié)劑組；F組：添加5%季銨鹽型單體的正畸托槽粘結(jié)劑組)。自凝樹脂包埋離體牙，僅暴露頰面，并用浮石和橡皮杯清潔和拋光，標(biāo)準(zhǔn)均質(zhì)化粘接。在37℃的人工唾液浴中浸泡1周, 并進(jìn)行約200次冷熱循環(huán)模擬，以此充分模擬口腔環(huán)境。通過萬能測試機(jī)檢測抗剪切強(qiáng)度，加載速度為1mm/min，勻速加載至托槽脫落并記錄最大剪切力值(N)。托槽底面=積托槽長×托槽寬，約11.7mm2。剪切粘結(jié)強(qiáng)度計(jì)算公式：剪切粘結(jié)強(qiáng)度=最大載荷/托槽底面積。

1.2.6 粘結(jié)劑殘留指數(shù) (ARI) 檢測：在10倍放大鏡下觀察殘留在托槽底板牙釉質(zhì)上的粘結(jié)劑量，并記錄粘結(jié)劑殘留指數(shù)。ARI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]：0分：牙面無粘結(jié)劑殘留；1分：牙面粘結(jié)劑殘留面積小于托槽底板面積的50%；2分；牙面粘結(jié)劑殘留面積大于托槽底板面積的50%；3分：粘結(jié)劑全部保留于牙面。

2 結(jié)果

2.1 最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC) 季銨鹽型抗菌單體對變形鏈球菌具有較強(qiáng)的抑制作用，最低抑菌濃度為20g/ml。低于20g/ml的濃度與陰性對照組的結(jié)果一致,對細(xì)菌生長沒有抑制作用。季銨鹽型抗菌單體對變形鏈球菌的最低殺菌濃度為45g/ml，MBC值為MIC的2.25倍。

2.2 抗菌性檢測結(jié)果 表1中的結(jié)果表明，具有季銨鹽型單體的正畸釉質(zhì)粘結(jié)劑對變形鏈球菌有明顯的抗菌作用。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與空白對照組相比，各組含不同比例的季銨鹽抗菌劑的正畸粘結(jié)劑差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與其余組比較，在抗菌劑添加比例為4%時(shí)，抗菌率最高。

表1添加不同比例季銨鹽單體抗菌劑的正畸釉質(zhì)粘結(jié)劑對變形鏈球菌殺菌率的比較

2.3 剪切粘結(jié)強(qiáng)度結(jié)果 6組離體牙的托槽抗剪粘結(jié)強(qiáng)度值見表2。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后，添加不同比例季銨鹽型單體的正畸托槽粘結(jié)劑組的剪切粘結(jié)強(qiáng)度無明顯差異，表明隨著抗菌劑添加比例的增加，不會(huì)影響粘結(jié)劑的抗剪切性能。

表2添加不同比例季銨鹽單體抗菌劑正畸釉質(zhì)粘結(jié)劑的托槽抗剪切粘結(jié)強(qiáng)度值

2.4 粘結(jié)劑殘留指數(shù)(ARI)分值 ARI記分可作為輔助指標(biāo)來衡量粘結(jié)劑與牙釉質(zhì)表面的粘結(jié)效果。根據(jù)表3中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，A組空白對照和5個(gè)實(shí)驗(yàn)組的ARI得分非常接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這也與剪切粘結(jié)強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

3 討論

正畸患者越來越多，尋求具有抗菌性能的新功能性齒科材料尤為重要。近年來，一些學(xué)者提出了“可聚合抗菌劑”的概念[6-7]，它是一種由抗菌基團(tuán)與可聚合基團(tuán)組成的一類既具有穩(wěn)定的抗菌活性，又能發(fā)生聚合反應(yīng)的分子，廣泛應(yīng)用于工業(yè)及制藥業(yè)等行業(yè)。目前，大多數(shù)“可聚合抗菌劑”都是基于季銨基團(tuán)并發(fā)揮抗菌作用的，因此它們統(tǒng)稱為季銨型抗菌單體。季銨鹽抗菌單體可與粘結(jié)劑中的常規(guī)單體交聯(lián)，因此對粘結(jié)劑本身的粘結(jié)性能沒有不利影響[8-9]。

表36組離體牙脫槽脫落后的ARI分值

本研究主要觀察添加不同比例季銨鹽單體抗菌劑正畸釉質(zhì)粘結(jié)劑抗菌性及抗剪切性能。首先，將變形鏈球菌作為評(píng)價(jià)菌株，結(jié)果顯示季銨鹽型抗菌單體對其具有較強(qiáng)的抑制作用，MIC為20g/ml，而MBC為45g/ml，MBC值為MIC的2.25倍，季銨鹽單體抗菌劑的適宜添加量為4%時(shí)，抗菌性能最強(qiáng)。

粘接系統(tǒng)作為牙體組織與修復(fù)體之間的橋梁，使用抗菌粘接劑是預(yù)防繼發(fā)齲的不二之選。季銨鹽型抗菌單體粘結(jié)劑在固化前可起到消毒作用[10]，快速殺滅去齲后殘余細(xì)菌，固化后，可以通過接觸抑制作用阻止細(xì)菌通過粘結(jié)界面侵襲深部牙本質(zhì)，以此預(yù)防繼發(fā)齲的發(fā)生，延長修復(fù)體使用壽命[11]。一種抗菌正畸粘結(jié)劑若要滿足臨床的要求，必須在具備長久的抗菌活性的前提下同時(shí)具有足夠的粘結(jié)強(qiáng)度，正畸治療中矯治器托槽能達(dá)到5.6～7.8MPa的抗剪切強(qiáng)度即可滿足臨床需要[12]。研究表明,當(dāng)體外實(shí)驗(yàn)的抗剪切強(qiáng)度>14MPa時(shí),移除托槽時(shí)會(huì)引起牙釉質(zhì)損害[13]。在本實(shí)驗(yàn)中，使用萬能測試機(jī)測試各組樣本托槽的抗剪切粘結(jié)強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同比例的季銨鹽抗菌單體的托槽抗剪粘結(jié)強(qiáng)度均符合臨床應(yīng)用范圍，是具有臨床可應(yīng)用性的。

綜上所述，季銨鹽型抗菌單體的使用可賦予托槽穩(wěn)定的抗菌性能而不影響粘結(jié)劑的粘結(jié)性能，具有臨床應(yīng)用意義。