馬利敏，楊海平，楊學(xué)文，阮林海

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia，ITP)是兒童最常見的出血性疾病，以皮膚黏膜出血和血小板計(jì)數(shù)減少為主要表現(xiàn)。兒童ITP是一種良性自限性疾病，絕大多數(shù)患兒病程小于3個(gè)月，預(yù)后良好，定義為新診斷ITP。但有20%～30%的患兒病程遷延反復(fù)，持續(xù)12個(gè)月以上，發(fā)展為慢性ITP[1]。科學(xué)研究表明，ITP是一種獲得性自身免疫性疾病，免疫功能紊亂、遺傳易感背景或繼發(fā)因素引起血小板破壞增加和再生障礙在ITP的發(fā)病中起著關(guān)鍵作用，但具體機(jī)制尚未完全闡明[2, 3]。

基因芯片是一種高效的生物信息檢測技術(shù)，能夠檢測樣本中基因的表達(dá)水平，具有高通量、多參數(shù)、平行化等特點(diǎn)，在功能基因組學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。生物信息學(xué)運(yùn)用信息科學(xué)的原理和技術(shù)分析基因組測序和其他高通量技術(shù)所產(chǎn)生的大規(guī)模分子數(shù)據(jù)集，使其更易解讀，已成為生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域所必需的工具[4]。本研究利用基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus，GEO)中兒童新診斷ITP相關(guān)基因芯片，對發(fā)病期和緩解期的基因表達(dá)譜進(jìn)行比較，探索兒童新診斷ITP分子特征的變化，通過生物信息學(xué)分析描述ITP相關(guān)基因的功能分布情況以及明確其所參與的主要代謝途徑和轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為深入探索兒童ITP發(fā)生的分子機(jī)制和指導(dǎo)早期治療提供基礎(chǔ)。

1資料與方法

1.1資料來源 從在線GEO數(shù)據(jù)庫中下載GSE56232基因芯片，該數(shù)據(jù)集包含了6例新診斷ITP患者發(fā)病期和緩解期的外周血T細(xì)胞表達(dá)譜[5]。試驗(yàn)共納入6例新診斷ITP患兒，年齡0.7-13.8歲。分別收集6例患兒發(fā)病期(發(fā)病一周內(nèi)且未接受任何治療)和緩解期(至少12個(gè)月后且血小板計(jì)數(shù)持續(xù)> 150 × 109/l)的外周血，分離T細(xì)胞并提取總RNA，然后采用GPL570平臺，即昂飛人類基因組U133 Plus 2.0基因芯片檢測表達(dá)譜。

1.2差異基因篩選 把GSE56232數(shù)據(jù)集導(dǎo)入BRB-ArrayTools軟件，進(jìn)行芯片信號值的預(yù)處理、過濾和標(biāo)準(zhǔn)化。以緩解期為對照組，發(fā)病期為實(shí)驗(yàn)組，采用基因芯片顯著性分析方法統(tǒng)計(jì)每個(gè)基因的顯著水平P值和誤判率Q值。本研究中差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)的篩選標(biāo)準(zhǔn)定義為：P<0.05，差異倍數(shù)≥2倍，同時(shí)計(jì)算基因間的Pearson相關(guān)系數(shù)，依照先基因、后樣本的順序?qū)Σ町惢蜻M(jìn)行聚類分析。

1.3功能富集分析 基因本體(Gene Ontology，GO)是基因功能的標(biāo)準(zhǔn)化分類體系，包括生物過程、分子功能、細(xì)胞組分三種類型。本研究基于GO數(shù)據(jù)庫，采用Fisher檢驗(yàn)計(jì)算GO富集各條目的富集水平P值，同時(shí)用Benjamini-Hochberg法校正以控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)，顯著富集GO條目的篩選標(biāo)準(zhǔn)定義為P<0.05，F(xiàn)DR<0.05。

1.4通路富集分析 通路富集分析是以KEGG數(shù)據(jù)庫中的Pathway為基本單位，向背景基因組映射，通過統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)從而明確差異基因所參與的主要代謝途徑和細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。本研究采用Fisher檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)差異基因在Pathway中的富集水平，顯著富集pathway的標(biāo)準(zhǔn)定義為P<0.05。

1.5互作網(wǎng)絡(luò)分析 對于差異基因的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，首先計(jì)算出各基因間的相關(guān)系數(shù)矩陣、各節(jié)點(diǎn)間的連接度和不相似度，再通過基因間的相互關(guān)系擬合基因的無標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，從而得到基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)[6]。根據(jù)圖論原理，以Pathway為研究對象，將顯著性富集的通路基于KEGG數(shù)據(jù)庫中的相互作用關(guān)系構(gòu)建通路互作網(wǎng)絡(luò)[7]。

2結(jié) 果

2.1差異基因篩選 以新診斷ITP緩解期為對照組，發(fā)病期為實(shí)驗(yàn)組，從外周血T細(xì)胞表達(dá)譜中共鑒定出582個(gè)DGEs，包含45個(gè)上調(diào)基因，537個(gè)下調(diào)基因，其中細(xì)胞周期蛋白M2(cyclin M2，CNNM2)和前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)分別在上調(diào)和下調(diào)基因中差異變化最顯著，部分差異基因列于表1。

表1 部分差異表達(dá)基因列表

2.2功能富集分析GO富集分析用來描述差異基因在功能分布上的情況。通過GO分類體系對差異基因注釋后發(fā)現(xiàn)，顯著富集的生物學(xué)過程共包括124個(gè)GO條目，主要包括DNA損傷與修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞周期、細(xì)胞因子、信號傳導(dǎo)、血液凝固、蛋白修飾、細(xì)胞粘附與遷移等，富集水平最顯著的前20個(gè)條目列于表2。另外，顯著富集的分子功能共涉及38個(gè)GO條目，主要包括蛋白結(jié)合、白介素6受體結(jié)合、整合素結(jié)合、ATP結(jié)合、微管結(jié)合、DNA結(jié)合、蛋白激酶活性等。

2.3通路富集分析 通路富集分析發(fā)現(xiàn)兒童新診斷ITP相關(guān)基因主要富集于細(xì)胞周期、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforminggrowthfactorβ，TGFβ)信號通路、白細(xì)胞遷移、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信號通路、細(xì)胞凋亡、Wnt通路等41個(gè)通路，富集水平最顯著的前15條通路列于表3。

表2 差異表達(dá)基因GO富集分析

表3 差異表達(dá)基因通路富集分析

2.4互作網(wǎng)絡(luò)分析 基于差異基因表達(dá)數(shù)據(jù)，通過基因間的相關(guān)系數(shù)擬合基因的無標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)關(guān)系構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，挖掘出的核心基因包括UBR3、ERBIN、KIF5B和SLK。基于KEGG數(shù)據(jù)庫中信號通路的關(guān)系，以圓點(diǎn)表示通路，帶箭頭的實(shí)線表示通路的上下游關(guān)系，構(gòu)建顯著性通路之間的互作網(wǎng)絡(luò)，挖掘出核心通路包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和MAPK信號通路。見圖1。

3討 論

ITP的病因與發(fā)病機(jī)制目前尚不完全明確，隨著研究的深入，兒童ITP被逐步認(rèn)為是一種免疫失耐受疾病。一般認(rèn)為ITP的發(fā)病是在遺傳易感基因的基礎(chǔ)上，在病毒感染或者接種疫苗等誘因下，機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能發(fā)生紊亂，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)在處理外來抗原或血小板抗原時(shí)不能獲得耐受。B細(xì)胞過度激活，產(chǎn)生抗血小板抗體而致敏血小板，單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)而吞噬致敏的血小板，而T細(xì)胞及其亞群功能異常使B細(xì)胞異常活化產(chǎn)生血小板表面相關(guān)抗原抗體，加速了血小板破壞[3, 8, 9]。

圖1通路相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

為了探索兒童新診斷ITP發(fā)病時(shí)基因表達(dá)水平的改變，本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫中相關(guān)基因芯片，對發(fā)病期和緩解期的表達(dá)譜進(jìn)行比較分析，結(jié)果共鑒定出582個(gè)差異基因，包括45個(gè)上調(diào)表達(dá)基因和537個(gè)下調(diào)表達(dá)基因，其中CNNM2和PTGS2分別在上調(diào)和下調(diào)基因中變化最為顯著。CNNM2主要參與鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)和鎂離子代謝平衡過程，其突變與腎性低鎂血癥相關(guān)[10]；PTGS也稱為環(huán)氧酶(Cyclooxygenase，COX)，是合成各種前列腺素的關(guān)鍵酶。COX有兩種同工酶，即組成型酶COX-1和誘導(dǎo)型酶COX-2。PTGS2基因編碼誘導(dǎo)型酶COX-2，其表達(dá)受特異性刺激調(diào)節(jié)，如白細(xì)胞介素1(interleukin1，IL-1)、腫瘤壞死因子、表皮生長因子、雌二醇、藥物等，參與炎癥反應(yīng)、有絲分裂、血管新生過程中前列腺素的合成，涉及NF-κB信號通路、血管內(nèi)皮生長因子受體信號通路等。有研究發(fā)現(xiàn)PTGS2和前列腺素E合成酶共表達(dá)于成熟巨核細(xì)胞和血小板中，PTGS2基因缺失延遲骨髓巨核細(xì)胞生成，釋放高反應(yīng)性血小板，增加體內(nèi)血栓形成能力，表明PTGS2表達(dá)有助于巨核細(xì)胞成熟和血小板形成[11,12]。聚類分析發(fā)現(xiàn)發(fā)病期和緩解期的表達(dá)譜在聚類樹圖中沒有重疊，表明新診斷ITP發(fā)病期和緩解期的分子特征不同。

功能富集和通路富集分析結(jié)果表明兒童新診斷ITP相關(guān)基因主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA損傷與修復(fù)、細(xì)胞周期、細(xì)胞因子、血液凝固、細(xì)胞粘附與遷移等生物學(xué)過程，涉及細(xì)胞周期、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、TGFβ信號通路、MAPK信號通路、細(xì)胞凋亡、Wnt通路等信號通路。新診斷ITP患兒血清中TGF-β1水平顯著高于正常對照組，患兒治療前血清TGF-β1水平高于治療后水平；且TGF-β1水平與ITP患兒血小板計(jì)數(shù)負(fù)相關(guān)，與骨髓內(nèi)巨核細(xì)胞數(shù)正相關(guān)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1在發(fā)病期表達(dá)水平升高，表明TGF-β1參與ITP的發(fā)病過程。造血系統(tǒng)中的TGF-β1是由巨核細(xì)胞和血小板生成，巨核細(xì)胞及血小板α顆粒是其最終存儲點(diǎn)。TGF-β1通過與巨核細(xì)胞表面的受體結(jié)合，啟動相應(yīng)的信號途徑發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)因子作用，使巨核細(xì)胞成熟障礙、血小板生成減少。ITP發(fā)病時(shí)，血小板壽命縮短和破壞增多使TGF-β1釋放到血液中，引起TGF-β1水平明顯增高，且TGF-β1與基質(zhì)細(xì)胞中血小板生成素的增高水平正相關(guān)，從而導(dǎo)致巨核細(xì)胞成熟障礙[14]。新診斷ITP患兒Th17細(xì)胞比例增高，Treg細(xì)胞比例下降；ITP患兒血漿中γ干擾素水平較正常對照組明顯升高，IL-4水平較正常對照組明顯降低，表明Th17/Treg細(xì)胞亞群比例失調(diào)、γ干擾素表達(dá)上調(diào)、IL-4表達(dá)下降可能是ITP發(fā)生的重要因素[15]。γ干擾素、IL-10水平在ITP患兒血清中升高，激活細(xì)胞毒性T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、補(bǔ)體形成，進(jìn)而吞噬破壞血小板。有研究報(bào)道新診斷ITP患兒血清中IL-16水平比持續(xù)性ITP和慢性ITP患兒高，持續(xù)性ITP患兒IL-16水平比慢性ITP患兒高，而且IL-16水平與血小板計(jì)數(shù)和網(wǎng)織血小板負(fù)相關(guān)，表明IL-16可用于預(yù)測兒童ITP的臨床病程[16]。另外，本研究網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)的核心基因包括UBR3、ERBIN、KIF5B和SLK，ERBIN參與NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性、腫瘤壞死因子、整合素信號通路、細(xì)胞粘附、表皮生長因子受體信號通路等，KIF5B涉及應(yīng)激脫顆粒、基于微管的胞內(nèi)運(yùn)輸、囊泡運(yùn)輸、蛋白定位、膜電位調(diào)節(jié)等，SLK主要參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、應(yīng)激激活蛋白激酶信號級聯(lián)反應(yīng)、蛋白磷酸化等，這些核心基因在兒童新診斷ITP發(fā)病期均表達(dá)下調(diào)，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

總之，通過對兒童新診斷ITP發(fā)病期和緩解期的芯片數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較和分析，新診斷ITP的發(fā)生涉及基因表達(dá)譜的改變。兒童新診斷ITP相關(guān)基因主要涉及細(xì)胞周期、細(xì)胞因子、細(xì)胞遷移、TGFβ信號通路、MAPK信號通路、細(xì)胞凋亡等生物過程與通路，為深入闡明兒童ITP發(fā)生的分子機(jī)制和指導(dǎo)治療干預(yù)提供了基礎(chǔ)。