郭 敏，盧恒謙，王順合，陳 衛(wèi)，趙建新*

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）屬藜科藜屬植物，富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪及粗纖維等多種營養(yǎng)成分及活性物質(zhì)[1-3]，最早在我國西藏等地區(qū)引種實驗，試種成功后逐步推廣至山西、甘肅、青海、四川等高海拔山區(qū)，目前在陜西、浙江、河北、北京、內(nèi)蒙古等地區(qū)都有種植[4-7]。

近年來，藜麥的營養(yǎng)成分分析已成為研究人員關(guān)注的焦點。國內(nèi)外學(xué)者通過不同的分析方法對藜麥的營養(yǎng)成分進(jìn)行研究，如Multari等[8]研究發(fā)現(xiàn)干燥溫度與藜麥總酚回收率之間的相關(guān)性；Hu Yichen等[9]研究提取技術(shù)對藜麥多糖含量的影響；Reguera等[10]研究品種及栽培產(chǎn)地對藜麥營養(yǎng)成分的影響。然而脂質(zhì)作為維持人體健康所必需的營養(yǎng)物質(zhì)之一，在表征藜麥的營養(yǎng)價值方面具有重要作用。但是國內(nèi)外學(xué)者對不同產(chǎn)地藜麥中脂肪酸的研究報道相對較少。其次，隨著藜麥種植地在全球范圍內(nèi)的不斷擴大，消費者對藜麥來源的關(guān)注程度與日俱增，藜麥的產(chǎn)地溯源問題也越來越引起人們的重視。目前利用代謝組學(xué)的方法，以小分子物質(zhì)為研究對象，通過氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用檢測和數(shù)據(jù)處理，進(jìn)行信息整合、生物標(biāo)記物的鑒定從而識別食品的來源，該方法也成為食品產(chǎn)地溯源的技術(shù)方法之一，薩日娜等[11]基于GC-MS代謝組學(xué)方法探討甘肅不同產(chǎn)地當(dāng)歸中揮發(fā)性成分與藥材生長環(huán)境的關(guān)系。馮雪[12]采用GC-MS技術(shù)建立稻米的代謝組學(xué)分析方法，并將其應(yīng)用于產(chǎn)地溯源。然而利用該方法用于藜麥產(chǎn)地溯源鮮見報道。

本研究著眼于藜麥中的脂肪酸及小分子代謝物，采用GC-MS對不同產(chǎn)地藜麥進(jìn)行分析，并結(jié)合無監(jiān)督模式的主成分分析（principal component analysis，PCA）和有監(jiān)督模式的正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）對產(chǎn)地與小分子代謝物之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，尋找不同產(chǎn)地間的差異化合物。旨在為進(jìn)一步研究國內(nèi)引種種植藜麥的營養(yǎng)價值及藜麥產(chǎn)地溯源技術(shù)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥樣品：9 批不同產(chǎn)地不同品種的藜麥樣品由青海高遠(yuǎn)錦禾生態(tài)農(nóng)牧科技有限公司提供，樣品于40 ℃烘干24 h后，密封置于4 ℃冰箱中備用。樣品來源信息見表1。

正己烷、甲醇（均為色譜純） 德國默克公司；氫氧化鈉（分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；N-甲基-N-三甲基硅三氟乙酰胺（N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide，MSTFA）、14%三氟化硼-甲醇溶液美國西格瑪公司；甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether，MTBE）（色譜純） 美國天地公司；無水吡啶、鹽酸甲氧胺 北京百靈威科技有限公司。

表 1 樣品來源信息Table 1 Information about quinoa samples

1.2 儀器與設(shè)備

QP2010 Ultra GC-MS聯(lián)用儀 島津企業(yè)管理（中國）有限公司；Rtx-Wax（0.25 mm×30 m，0.25 μm）、Rtx-5 MS毛細(xì)管色譜柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm）美國瑞思泰康公司；Trace1310-TSQ 8000 Evo GC-MS聯(lián)用儀、LEGEND MICRO 17離心機 美國賽默飛公司；QGC-24T氮吹儀 上海泉島公司；Milli-Q8超純水發(fā)生器 美國密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 小分子物質(zhì)提取

藜麥研磨成粉，準(zhǔn)確稱取10 mg藜麥粉轉(zhuǎn)移到提脂瓶中，采用MTBE法[13-14]，樣品加入高純水40 μL，渦旋振蕩30 s后加入甲醇300 μL，渦旋振蕩30 s后再加入MTBE 1 000 μL，再渦旋振蕩30 s后置于室溫下，于振蕩器60 r/min孵育1 h。孵育后加入高純水250 μL，渦旋振蕩30 s后在室溫下靜置10 min，3 600 r/min離心10 min，將上層溶劑加入到新的提脂瓶中，然后按照甲醇∶MTBE∶H2O=1∶3∶2.5體積比混合，靜置后取混合液的上層溶劑1 000 μL再萃取1 次，合并2 次萃取液，用氮氣吹干，即得到脂質(zhì)粗提物。取下層溶液用氮氣吹干，即得到樣品中的小分子物質(zhì)。

1.3.2 脂質(zhì)甲酯化

向脂質(zhì)粗提取物中加入0.5 mol/L NaOH-甲醇溶液1 mL，混勻后充氮氣于95 ℃加熱5 min，冷卻至室溫后加入14%三氟化硼-甲醇溶液1 mL，充氮氣于95 ℃加熱5 min，冷卻至室溫后加入飽和NaCl溶液1 mL，混勻后再加入正己烷1 mL，混勻，2 000 r/min離心10 min，取上層溶液，如此重復(fù)提取1 次，混合2 次提取的上層有機相，氮氣吹干，用200 μL正己烷復(fù)溶，裝入1.5 mL進(jìn)樣小瓶，用于GC-MS分析。

1.3.3 衍生化

向干燥后的小分子物質(zhì)中加入10%甲氧胺鹽酸鹽-吡啶100 μL，37 ℃金屬浴90 min；然后加入MSTFA 40 μL 37 ℃金屬浴60 min；反應(yīng)完畢后12 000×g離心20 min，吸取上清液100 μL至GC瓶中用于GC-MS分析。

1.3.4 脂肪酸分析

使用QP2010 Ultra GC-MS聯(lián)用儀，GC條件：色譜柱：Rtx-Wax石英毛細(xì)管色譜柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm）；升溫程序：150 ℃保持2 min，以10 ℃/min升至190 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至220 ℃，保持16 min；載氣（He）流速1.5 mL/min，進(jìn)樣量1 μL；分流比10∶1。MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；接口溫度250 ℃；離子源溫度220 ℃；掃描方式為全掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z 50～550。

1.3.5 極性小分子物質(zhì)分析

使用Trace1310-TSQ 8000 Evo GC-MS聯(lián)用儀，GC條件：色譜柱：Rtx-5MS石英毛細(xì)管色譜柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm）；升溫程序：70 ℃保持1 min，以5 ℃/min升至150 ℃，以10 ℃/min升至200 ℃，以70 ℃/min升至320 ℃，保持8 min；載氣（He）流速1.5 mL/min，壓力2.4 kPa，進(jìn)樣量1 μL；分流比10∶1。MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；接口溫度280 ℃；離子源溫度300 ℃；掃描方式為全掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z 33～600。1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行差異顯著性分析；應(yīng)用基于R代碼的XCMS軟件分析進(jìn)行譜峰基線校正、峰識別和匹配、消除噪音等預(yù)處理；應(yīng)用SIMCA 14.1分析軟件進(jìn)行PCA和OPLS-DA，用NIST 11標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行差異化合物的檢索與鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地藜麥中脂肪酸的測定結(jié)果

采用GC-MS分析不同產(chǎn)地藜麥樣品中的脂質(zhì)提取物，通過脂肪酸甲酯特征離子的提取，經(jīng)NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫對比、標(biāo)樣驗證后，確定藜麥脂肪酸組成及含量，結(jié)果見表2和圖1。

表 2 不同產(chǎn)地藜麥脂質(zhì)提取物的脂肪酸組成及含量Table 2 Fatty acid composition and contents in quinoa samples from different regions

由表2可知，不同產(chǎn)地藜麥中的脂肪酸組成相似，但含量有顯著差異，其中亞油酸（C18:2）相對含量最高，均在50%左右。張婷婷[15]分析產(chǎn)自云南香格里拉藜麥的主要成分，發(fā)現(xiàn)香格里拉藜麥中含有大量的不飽和脂肪酸，主要是亞油酸，這一結(jié)果與本研究一致。

不同產(chǎn)地的藜麥脂肪酸含量存在顯著差異（P＜0.05）。表2結(jié)果表明，不同產(chǎn)地藜麥中脂肪酸含量顯著性差異最高的是油酸（C18:1）。樣品S01的亞油酸（C18:2）相對含量最高，樣品S07的油酸（C18:1）相對含量最高，樣品S08的α-亞麻酸（C18:3）相對含量最高。由圖1可知，藜麥中脂肪酸組成主要是不飽和脂肪酸，占總脂肪酸80%以上，碳鏈為14～22，以常規(guī)的偶數(shù)碳脂肪酸為主。其中樣品S09的不飽和脂肪酸相對含量最高，占總脂肪酸83.16%，同王黎明等[16]在分析藜麥營養(yǎng)價值時發(fā)現(xiàn)藜麥中的主要脂肪酸為不飽和脂肪酸的結(jié)果一致，且主要不飽和脂肪酸比例結(jié)果也與本研究相似；此外，由圖1可知，產(chǎn)于青海S09和S05藜麥樣品的不飽和脂肪酸含量要高于其他產(chǎn)地的藜麥。周海濤等[17]在研究藜麥在張家口地區(qū)的試種表現(xiàn)時發(fā)現(xiàn)，適宜的生態(tài)條件有利于藜麥產(chǎn)量及營養(yǎng)成分的提升，所以在本研究中產(chǎn)于青海的藜麥樣品S09和S05不飽和脂肪酸含量高于其他樣品，可能是因為青海產(chǎn)地整體的海拔、氣候、土壤等自然條件比較適合S09、S05藜麥品種的生長。

2.2 不同產(chǎn)地藜麥中小分子物質(zhì)的測定結(jié)果

對表1中9 種藜麥樣品進(jìn)行GC-MS分析，采集到的數(shù)據(jù)經(jīng)過基于R代碼的XCMS軟件進(jìn)行譜峰基線校正、峰識別和匹配、消除噪音等預(yù)處理后得到2 753 個質(zhì)譜碎片。然后采用SIMCA-P14.1軟件對質(zhì)譜碎片進(jìn)行PCA和OPLS-DA[18-20]，從而得到具有差異性的52 個質(zhì)譜碎片，最后通過NIST 11標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行檢索，經(jīng)鑒定得出4 種差異化合物。

2.2.1 PCA

通過PCA得分圖上散點位置的分布可以比較直觀地展現(xiàn)樣品或組別之間的差異[21-23]。對不同產(chǎn)地藜麥樣品的GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行無監(jiān)督PCA，從整體上觀察各組分離趨勢及組間空間上的分布情況，結(jié)果見圖2。

圖 2 不同產(chǎn)地藜麥樣品的PCA得分圖Fig. 2 PCA score plots for quinoa samples from different regions

由圖2可知，9 批藜麥樣品分散在A、B、C 3 個區(qū)域，其中A區(qū)域包括的樣品S04、S06和S07均來自于秘魯，B區(qū)域包括的樣品S01、S03和S08均來自于云南，C區(qū)域包括的樣品S02、S05和S09均來自于青海，說明同一產(chǎn)地藜麥樣品中小分子物質(zhì)含量具有相似性；B、C區(qū)域的樣本聚合度較好，說明來自云南和秘魯?shù)霓见湻N間差異較?。籄區(qū)域S07與S04和S06的位置相對分散，說明S07號樣品與S04、S06號樣品有差異。

2.2.2 OPLS-DA

為進(jìn)一步驗證各樣本之間的分離情況，從中識別有效的差異化合物，采用有監(jiān)督模式OPLS-DA，對不同產(chǎn)地的藜麥樣品按照產(chǎn)地進(jìn)行分組，對藜麥中小分子物質(zhì)與產(chǎn)地之間的相關(guān)性進(jìn)行分析[24-25]。將9 批樣品分成3 組（青海、云南、秘魯），每兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA，其得分圖及S-plots見圖3。

從圖3A可以看出，藜麥樣品根據(jù)產(chǎn)地分離情況良好，說明不同產(chǎn)地的藜麥樣品中的小分子物質(zhì)組成存在明顯的差異。由圖3B可知，S-plots圖中距離中心點越遠(yuǎn)（標(biāo)紅的點）說明此因子對產(chǎn)地分類的貢獻(xiàn)系數(shù)越大，是潛在的差異化合物。

2.2.3 差異性化合物的篩選及鑒定分析

通過OPLS-DA過濾不相關(guān)的正交信號，獲得更加可靠的差異物信息。選取各組間OPLS-DA模型第1主成分的變量投影重要性（variable important for the projection，VIP）值（VIP＞2）進(jìn)行3 組之間共同差異物的篩選（圖4），并結(jié)合One-Way ANOVA方差分析（P＜0.05）尋找差異性化合物，結(jié)果見表3。

圖 4 差異化合物篩選結(jié)果Fig. 4 Screening for differential compounds

表 3 差異化合物鑒定Table 3 Identification of differential compounds

由圖4和表3可知，篩選出的52 個質(zhì)譜碎片，經(jīng)與NIST 11數(shù)據(jù)庫檢索對比，鑒定出4 種差異性化合物，分別為D-葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和核糖醇?？赡苁且驗樘穷愖鳛檗见湹膬?nèi)源性代謝物，當(dāng)其生長的環(huán)境在發(fā)生變化時，糖類含量也隨之變化，最終導(dǎo)致不同產(chǎn)地藜麥營養(yǎng)成分產(chǎn)生顯著性差異。

3 結(jié)論與討論

本研究采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)同時提取測定不同產(chǎn)地藜麥中脂肪酸及小分子物質(zhì)組成。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地藜麥中的脂肪酸組成相似，且不同產(chǎn)地脂肪酸含量存在顯著性差異；其中亞油酸相對含量最高，均在50%左右。上述結(jié)果揭示不同產(chǎn)地藜麥脂肪酸組成存在相似性和差異性。結(jié)合PCA和POLS-DA法，對不同產(chǎn)地藜麥小分子物質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示小分子物質(zhì)與產(chǎn)地具有相關(guān)性，D-葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和核糖醇是藜麥樣品中的差異性化合物。

本研究通過對不同產(chǎn)地藜麥中脂肪酸含量測定及小分子物質(zhì)差異性比較，以期對進(jìn)一步研究國內(nèi)引種種植藜麥的營養(yǎng)價值及藜麥產(chǎn)地溯源技術(shù)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究表明不同產(chǎn)地脂肪酸含量存在顯著差異；其中亞油酸含量最高，均在50%左右；這與張婷婷[15]對藜麥的報道相一致。糖類是不同產(chǎn)地藜麥小分子物質(zhì)的差異性化合物，馮雪[12]研究也發(fā)現(xiàn)蔗糖、麥芽糖、海藻糖為稻米的差異性標(biāo)志物，這與本研究結(jié)果相似。但是本研究僅對不同產(chǎn)地藜麥中營養(yǎng)成分及產(chǎn)地溯源方法進(jìn)行探索，今后可以通過擴大采樣范圍及采樣品種的方法，獲取更多的樣本信息進(jìn)行分析，從而通過建立產(chǎn)地判別模型，篩選出更有效的產(chǎn)地溯源標(biāo)志物，為進(jìn)一步研究國內(nèi)引種種植的藜麥的營養(yǎng)價值及產(chǎn)地歸屬提供物質(zhì)基礎(chǔ)[26-28]。