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        基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的不同產(chǎn)地藜麥中脂肪酸及小分子物質(zhì)組成分析

        2019-05-21 11:59:30盧恒謙王順合趙建新
        食品科學(xué) 2019年8期
        關(guān)鍵詞:產(chǎn)地脂肪酸化合物

        郭 敏,盧恒謙,王順合,陳 衛(wèi),趙建新*

        (江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇 無錫 214122)

        藜麥(Chenopodium quinoa Willd.)屬藜科藜屬植物,富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪及粗纖維等多種營養(yǎng)成分及活性物質(zhì)[1-3],最早在我國西藏等地區(qū)引種實(shí)驗(yàn),試種成功后逐步推廣至山西、甘肅、青海、四川等高海拔山區(qū),目前在陜西、浙江、河北、北京、內(nèi)蒙古等地區(qū)都有種植[4-7]。

        近年來,藜麥的營養(yǎng)成分分析已成為研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)。國內(nèi)外學(xué)者通過不同的分析方法對藜麥的營養(yǎng)成分進(jìn)行研究,如Multari等[8]研究發(fā)現(xiàn)干燥溫度與藜麥總酚回收率之間的相關(guān)性;Hu Yichen等[9]研究提取技術(shù)對藜麥多糖含量的影響;Reguera等[10]研究品種及栽培產(chǎn)地對藜麥營養(yǎng)成分的影響。然而脂質(zhì)作為維持人體健康所必需的營養(yǎng)物質(zhì)之一,在表征藜麥的營養(yǎng)價(jià)值方面具有重要作用。但是國內(nèi)外學(xué)者對不同產(chǎn)地藜麥中脂肪酸的研究報(bào)道相對較少。其次,隨著藜麥種植地在全球范圍內(nèi)的不斷擴(kuò)大,消費(fèi)者對藜麥來源的關(guān)注程度與日俱增,藜麥的產(chǎn)地溯源問題也越來越引起人們的重視。目前利用代謝組學(xué)的方法,以小分子物質(zhì)為研究對象,通過氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)聯(lián)用檢測和數(shù)據(jù)處理,進(jìn)行信息整合、生物標(biāo)記物的鑒定從而識別食品的來源,該方法也成為食品產(chǎn)地溯源的技術(shù)方法之一,薩日娜等[11]基于GC-MS代謝組學(xué)方法探討甘肅不同產(chǎn)地當(dāng)歸中揮發(fā)性成分與藥材生長環(huán)境的關(guān)系。馮雪[12]采用GC-MS技術(shù)建立稻米的代謝組學(xué)分析方法,并將其應(yīng)用于產(chǎn)地溯源。然而利用該方法用于藜麥產(chǎn)地溯源鮮見報(bào)道。

        本研究著眼于藜麥中的脂肪酸及小分子代謝物,采用GC-MS對不同產(chǎn)地藜麥進(jìn)行分析,并結(jié)合無監(jiān)督模式的主成分分析(principal component analysis,PCA)和有監(jiān)督模式的正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)對產(chǎn)地與小分子代謝物之間的相關(guān)性進(jìn)行分析,尋找不同產(chǎn)地間的差異化合物。旨在為進(jìn)一步研究國內(nèi)引種種植藜麥的營養(yǎng)價(jià)值及藜麥產(chǎn)地溯源技術(shù)提供數(shù)據(jù)支撐。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        藜麥樣品:9 批不同產(chǎn)地不同品種的藜麥樣品由青海高遠(yuǎn)錦禾生態(tài)農(nóng)牧科技有限公司提供,樣品于40 ℃烘干24 h后,密封置于4 ℃冰箱中備用。樣品來源信息見表1。

        正己烷、甲醇(均為色譜純) 德國默克公司;氫氧化鈉(分析純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;N-甲基-N-三甲基硅三氟乙酰胺(N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide,MSTFA)、14%三氟化硼-甲醇溶液美國西格瑪公司;甲基叔丁基醚(methyl tert-butyl ether,MTBE)(色譜純) 美國天地公司;無水吡啶、鹽酸甲氧胺 北京百靈威科技有限公司。

        表 1 樣品來源信息Table 1 Information about quinoa samples

        1.2 儀器與設(shè)備

        QP2010 Ultra GC-MS聯(lián)用儀 島津企業(yè)管理(中國)有限公司;Rtx-Wax(0.25 mm×30 m,0.25 μm)、Rtx-5 MS毛細(xì)管色譜柱(0.25 mm×30 m,0.25 μm)美國瑞思泰康公司;Trace1310-TSQ 8000 Evo GC-MS聯(lián)用儀、LEGEND MICRO 17離心機(jī) 美國賽默飛公司;QGC-24T氮吹儀 上海泉島公司;Milli-Q8超純水發(fā)生器 美國密理博公司。

        1.3 方法

        1.3.1 小分子物質(zhì)提取

        藜麥研磨成粉,準(zhǔn)確稱取10 mg藜麥粉轉(zhuǎn)移到提脂瓶中,采用MTBE法[13-14],樣品加入高純水40 μL,渦旋振蕩30 s后加入甲醇300 μL,渦旋振蕩30 s后再加入MTBE 1 000 μL,再渦旋振蕩30 s后置于室溫下,于振蕩器60 r/min孵育1 h。孵育后加入高純水250 μL,渦旋振蕩30 s后在室溫下靜置10 min,3 600 r/min離心10 min,將上層溶劑加入到新的提脂瓶中,然后按照甲醇∶MTBE∶H2O=1∶3∶2.5體積比混合,靜置后取混合液的上層溶劑1 000 μL再萃取1 次,合并2 次萃取液,用氮?dú)獯蹈桑吹玫街|(zhì)粗提物。取下層溶液用氮?dú)獯蹈桑吹玫綐悠分械男》肿游镔|(zhì)。

        1.3.2 脂質(zhì)甲酯化

        向脂質(zhì)粗提取物中加入0.5 mol/L NaOH-甲醇溶液1 mL,混勻后充氮?dú)庥?5 ℃加熱5 min,冷卻至室溫后加入14%三氟化硼-甲醇溶液1 mL,充氮?dú)庥?5 ℃加熱5 min,冷卻至室溫后加入飽和NaCl溶液1 mL,混勻后再加入正己烷1 mL,混勻,2 000 r/min離心10 min,取上層溶液,如此重復(fù)提取1 次,混合2 次提取的上層有機(jī)相,氮?dú)獯蹈?,?00 μL正己烷復(fù)溶,裝入1.5 mL進(jìn)樣小瓶,用于GC-MS分析。

        1.3.3 衍生化

        向干燥后的小分子物質(zhì)中加入10%甲氧胺鹽酸鹽-吡啶100 μL,37 ℃金屬浴90 min;然后加入MSTFA 40 μL 37 ℃金屬浴60 min;反應(yīng)完畢后12 000×g離心20 min,吸取上清液100 μL至GC瓶中用于GC-MS分析。

        1.3.4 脂肪酸分析

        使用QP2010 Ultra GC-MS聯(lián)用儀,GC條件:色譜柱:Rtx-Wax石英毛細(xì)管色譜柱(0.25 mm×30 m,0.25 μm);升溫程序:150 ℃保持2 min,以10 ℃/min升至190 ℃,保持5 min,以5 ℃/min升至220 ℃,保持16 min;載氣(He)流速1.5 mL/min,進(jìn)樣量1 μL;分流比10∶1。MS條件:電子電離源;電子能量70 eV;接口溫度250 ℃;離子源溫度220 ℃;掃描方式為全掃描;質(zhì)量掃描范圍m/z 50~550。

        1.3.5 極性小分子物質(zhì)分析

        使用Trace1310-TSQ 8000 Evo GC-MS聯(lián)用儀,GC條件:色譜柱:Rtx-5MS石英毛細(xì)管色譜柱(0.25 mm×30 m,0.25 μm);升溫程序:70 ℃保持1 min,以5 ℃/min升至150 ℃,以10 ℃/min升至200 ℃,以70 ℃/min升至320 ℃,保持8 min;載氣(He)流速1.5 mL/min,壓力2.4 kPa,進(jìn)樣量1 μL;分流比10∶1。MS條件:電子電離源;電子能量70 eV;接口溫度280 ℃;離子源溫度300 ℃;掃描方式為全掃描;質(zhì)量掃描范圍m/z 33~600。1.4 數(shù)據(jù)處理

        應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析;應(yīng)用基于R代碼的XCMS軟件分析進(jìn)行譜峰基線校正、峰識別和匹配、消除噪音等預(yù)處理;應(yīng)用SIMCA 14.1分析軟件進(jìn)行PCA和OPLS-DA,用NIST 11標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行差異化合物的檢索與鑒定。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同產(chǎn)地藜麥中脂肪酸的測定結(jié)果

        采用GC-MS分析不同產(chǎn)地藜麥樣品中的脂質(zhì)提取物,通過脂肪酸甲酯特征離子的提取,經(jīng)NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫對比、標(biāo)樣驗(yàn)證后,確定藜麥脂肪酸組成及含量,結(jié)果見表2和圖1。

        表 2 不同產(chǎn)地藜麥脂質(zhì)提取物的脂肪酸組成及含量Table 2 Fatty acid composition and contents in quinoa samples from different regions

        由表2可知,不同產(chǎn)地藜麥中的脂肪酸組成相似,但含量有顯著差異,其中亞油酸(C18:2)相對含量最高,均在50%左右。張婷婷[15]分析產(chǎn)自云南香格里拉藜麥的主要成分,發(fā)現(xiàn)香格里拉藜麥中含有大量的不飽和脂肪酸,主要是亞油酸,這一結(jié)果與本研究一致。

        不同產(chǎn)地的藜麥脂肪酸含量存在顯著差異(P<0.05)。表2結(jié)果表明,不同產(chǎn)地藜麥中脂肪酸含量顯著性差異最高的是油酸(C18:1)。樣品S01的亞油酸(C18:2)相對含量最高,樣品S07的油酸(C18:1)相對含量最高,樣品S08的α-亞麻酸(C18:3)相對含量最高。由圖1可知,藜麥中脂肪酸組成主要是不飽和脂肪酸,占總脂肪酸80%以上,碳鏈為14~22,以常規(guī)的偶數(shù)碳脂肪酸為主。其中樣品S09的不飽和脂肪酸相對含量最高,占總脂肪酸83.16%,同王黎明等[16]在分析藜麥營養(yǎng)價(jià)值時(shí)發(fā)現(xiàn)藜麥中的主要脂肪酸為不飽和脂肪酸的結(jié)果一致,且主要不飽和脂肪酸比例結(jié)果也與本研究相似;此外,由圖1可知,產(chǎn)于青海S09和S05藜麥樣品的不飽和脂肪酸含量要高于其他產(chǎn)地的藜麥。周海濤等[17]在研究藜麥在張家口地區(qū)的試種表現(xiàn)時(shí)發(fā)現(xiàn),適宜的生態(tài)條件有利于藜麥產(chǎn)量及營養(yǎng)成分的提升,所以在本研究中產(chǎn)于青海的藜麥樣品S09和S05不飽和脂肪酸含量高于其他樣品,可能是因?yàn)榍嗪.a(chǎn)地整體的海拔、氣候、土壤等自然條件比較適合S09、S05藜麥品種的生長。

        2.2 不同產(chǎn)地藜麥中小分子物質(zhì)的測定結(jié)果

        對表1中9 種藜麥樣品進(jìn)行GC-MS分析,采集到的數(shù)據(jù)經(jīng)過基于R代碼的XCMS軟件進(jìn)行譜峰基線校正、峰識別和匹配、消除噪音等預(yù)處理后得到2 753 個(gè)質(zhì)譜碎片。然后采用SIMCA-P14.1軟件對質(zhì)譜碎片進(jìn)行PCA和OPLS-DA[18-20],從而得到具有差異性的52 個(gè)質(zhì)譜碎片,最后通過NIST 11標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行檢索,經(jīng)鑒定得出4 種差異化合物。

        2.2.1 PCA

        通過PCA得分圖上散點(diǎn)位置的分布可以比較直觀地展現(xiàn)樣品或組別之間的差異[21-23]。對不同產(chǎn)地藜麥樣品的GC-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行無監(jiān)督PCA,從整體上觀察各組分離趨勢及組間空間上的分布情況,結(jié)果見圖2。

        圖 2 不同產(chǎn)地藜麥樣品的PCA得分圖Fig. 2 PCA score plots for quinoa samples from different regions

        由圖2可知,9 批藜麥樣品分散在A、B、C 3 個(gè)區(qū)域,其中A區(qū)域包括的樣品S04、S06和S07均來自于秘魯,B區(qū)域包括的樣品S01、S03和S08均來自于云南,C區(qū)域包括的樣品S02、S05和S09均來自于青海,說明同一產(chǎn)地藜麥樣品中小分子物質(zhì)含量具有相似性;B、C區(qū)域的樣本聚合度較好,說明來自云南和秘魯?shù)霓见湻N間差異較??;A區(qū)域S07與S04和S06的位置相對分散,說明S07號樣品與S04、S06號樣品有差異。

        2.2.2 OPLS-DA

        為進(jìn)一步驗(yàn)證各樣本之間的分離情況,從中識別有效的差異化合物,采用有監(jiān)督模式OPLS-DA,對不同產(chǎn)地的藜麥樣品按照產(chǎn)地進(jìn)行分組,對藜麥中小分子物質(zhì)與產(chǎn)地之間的相關(guān)性進(jìn)行分析[24-25]。將9 批樣品分成3 組(青海、云南、秘魯),每兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA,其得分圖及S-plots見圖3。

        從圖3A可以看出,藜麥樣品根據(jù)產(chǎn)地分離情況良好,說明不同產(chǎn)地的藜麥樣品中的小分子物質(zhì)組成存在明顯的差異。由圖3B可知,S-plots圖中距離中心點(diǎn)越遠(yuǎn)(標(biāo)紅的點(diǎn))說明此因子對產(chǎn)地分類的貢獻(xiàn)系數(shù)越大,是潛在的差異化合物。

        2.2.3 差異性化合物的篩選及鑒定分析

        通過OPLS-DA過濾不相關(guān)的正交信號,獲得更加可靠的差異物信息。選取各組間OPLS-DA模型第1主成分的變量投影重要性(variable important for the projection,VIP)值(VIP>2)進(jìn)行3 組之間共同差異物的篩選(圖4),并結(jié)合One-Way ANOVA方差分析(P<0.05)尋找差異性化合物,結(jié)果見表3。

        圖 4 差異化合物篩選結(jié)果Fig. 4 Screening for differential compounds

        表 3 差異化合物鑒定Table 3 Identification of differential compounds

        由圖4和表3可知,篩選出的52 個(gè)質(zhì)譜碎片,經(jīng)與NIST 11數(shù)據(jù)庫檢索對比,鑒定出4 種差異性化合物,分別為D-葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和核糖醇??赡苁且?yàn)樘穷愖鳛檗见湹膬?nèi)源性代謝物,當(dāng)其生長的環(huán)境在發(fā)生變化時(shí),糖類含量也隨之變化,最終導(dǎo)致不同產(chǎn)地藜麥營養(yǎng)成分產(chǎn)生顯著性差異。

        3 結(jié)論與討論

        本研究采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)同時(shí)提取測定不同產(chǎn)地藜麥中脂肪酸及小分子物質(zhì)組成。結(jié)果表明,不同產(chǎn)地藜麥中的脂肪酸組成相似,且不同產(chǎn)地脂肪酸含量存在顯著性差異;其中亞油酸相對含量最高,均在50%左右。上述結(jié)果揭示不同產(chǎn)地藜麥脂肪酸組成存在相似性和差異性。結(jié)合PCA和POLS-DA法,對不同產(chǎn)地藜麥小分子物質(zhì)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示小分子物質(zhì)與產(chǎn)地具有相關(guān)性,D-葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和核糖醇是藜麥樣品中的差異性化合物。

        本研究通過對不同產(chǎn)地藜麥中脂肪酸含量測定及小分子物質(zhì)差異性比較,以期對進(jìn)一步研究國內(nèi)引種種植藜麥的營養(yǎng)價(jià)值及藜麥產(chǎn)地溯源技術(shù)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究表明不同產(chǎn)地脂肪酸含量存在顯著差異;其中亞油酸含量最高,均在50%左右;這與張婷婷[15]對藜麥的報(bào)道相一致。糖類是不同產(chǎn)地藜麥小分子物質(zhì)的差異性化合物,馮雪[12]研究也發(fā)現(xiàn)蔗糖、麥芽糖、海藻糖為稻米的差異性標(biāo)志物,這與本研究結(jié)果相似。但是本研究僅對不同產(chǎn)地藜麥中營養(yǎng)成分及產(chǎn)地溯源方法進(jìn)行探索,今后可以通過擴(kuò)大采樣范圍及采樣品種的方法,獲取更多的樣本信息進(jìn)行分析,從而通過建立產(chǎn)地判別模型,篩選出更有效的產(chǎn)地溯源標(biāo)志物,為進(jìn)一步研究國內(nèi)引種種植的藜麥的營養(yǎng)價(jià)值及產(chǎn)地歸屬提供物質(zhì)基礎(chǔ)[26-28]。

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