李文婷，頓 倩，李紅艷，鄧澤元，張 兵*

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

赤豆（Vigna angularis）又名紅小豆、紅豆，是一種重要的豆科類作物。赤豆含有黃酮、皂苷、植物甾醇、赤豆紅色素等生物活性物質[1]，作為藥食同源作物，赤豆除供日常食用外，在功能食品和醫(yī)藥領域[2-3]的應用受到越來越多的關注。研究表明，赤豆汁可以降低健康年輕女性的血清三酰甘油濃度[4]，赤豆提取物具有減肥[5]、有效減緩血壓升高[6]、抑制血清膽固醇濃度[7]、抑制高血糖[8]等功效，赤豆莢果黃酮提取物對Fe2+導致的大鼠原代肝細胞氧化損傷具有保護作用[9]。

豆類植物較高的抗氧化活性與其豐富的多酚、黃酮及花色苷等物質含量密切相關[10-12]。已有研究表明[13-15]，存在于植物中的天然抗氧化劑如多酚、生育酚、類胡蘿卜素等植物化學物，可以起到保持人體健康、預防慢性疾病的作用。植物體中的天然多酚類物質主要包括酚酸、黃酮和單寧類物質[16]。存在于植物中的酚類物質主要包括有機溶劑可直接提取的可溶性酚類和有機溶劑不可直接提取的結合態(tài)酚類?？扇苄苑宇愄崛∥镏谐坞x形態(tài)存在以外，還可通過酯鍵、醚鍵、糖苷鍵的形式與其他物質結合[17]。將有機溶劑提取后的上清液經(jīng)過堿、酸水解處理，并進行萃取，可從有機溶劑提取液中分別提取出游離態(tài)酚類、酯鍵合態(tài)酚類、糖苷鍵合態(tài)酚類。有研究[16,18-19]對紅棗中酚類物質進行研究，分別提取出游離態(tài)、酯鍵合態(tài)、糖苷鍵合態(tài)和堿解結合態(tài)酚類。

至今，對于赤豆中不同鍵合形態(tài)酚類物質（游離態(tài)、酯鍵合態(tài)、糖苷鍵合態(tài)）的含量及其抗氧化活性方面，鮮見相關研究報道。因此，基于前人對酚類物質及赤豆植物化學物的相關研究，本研究的主要目的是評價赤豆中游離態(tài)、酯鍵合態(tài)、糖苷鍵合態(tài)酚類物質含量，并進行體外抗氧化活性研究，采用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質譜（ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q TOF-MS）和高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質譜（high performance liquid chromatography coupled with triple quadruple mass spectrometry，HPLCQQQ-MS）聯(lián)用技術對赤豆80%甲醇溶液提取物中酚類物質進行定性、定量分析，以更好地了解赤豆的營養(yǎng)保健作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤豆，2015年12月購于南昌當?shù)爻小?/p>

沒食子酸、兒茶素、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、綠原酸、對香豆酸、木犀草素、金絲桃苷、蘆丁、黃豆苷元、黃豆黃素、槲皮素、奎諾二甲基丙烯酸酯（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carbox，Trolox）、2,4,6-三吡啶基三嗪（2,4,6-tripyridine triazine，TPTZ）、2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS） 上海阿拉丁試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 成都西亞化工股份有限公司；福林-酚試劑 上海荔達生物科技有限公司；無水甲醇、FeCl3·6H2O、乙酸乙酯、鹽酸、硫酸、冰醋酸、K2S2O8、三水醋酸鈉、NaOH、Na2CO3、NaNO2、FeSO4西隴科學股份有限公司；乙醚 國藥集團化學試劑有限公司；AlCl3天津恒興化學試劑制造有限公司。

1.2 儀器與設備

HY-2調速多用振蕩器、N-1100旋轉蒸發(fā)儀 上海比朗儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州市華普達教學儀器有限公司；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；TDL-5-A離心機 上海安亭科學儀器廠；酶標儀 美國伯騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酚類物質提取及測定

準確稱取1.00 g研磨好的赤豆粉末于50 mL離心管中，按1∶15（g/mL）料液比加入15 mL 80%甲醇溶液，室溫條件下超聲提取1 h，4 200×g離心10 min后收集上清液，重復提取4 次，合并甲醇提取液用于游離態(tài)、酯鍵合態(tài)和糖苷鍵合態(tài)酚類物質分析，樣品于-20 ℃冰箱貯藏備用。

1.3.1.1 不同鍵合態(tài)提取液的制備

不同鍵合態(tài)提取液的制備參考文獻[16,18-19]方法，具體提取方法如下：

游離態(tài)酚類的制備：將赤豆80%甲醇提取液于35 ℃旋轉蒸發(fā)至20 mL，用6 mol/L HCl溶液調pH 2，該部分酚類物質通過加入等體積有機溶劑（體積比1∶1的乙醚-乙酸乙酯混合溶液）進行萃取，重復萃取5 次。將萃取分離的有機相合并，35 ℃旋轉蒸發(fā)至干后，復溶于5 mL 80%甲醇溶液中，即為游離態(tài)酚類提取物，樣品于-20 ℃冰箱貯藏備用。

酯鍵合態(tài)酚類的制備：向上述提取過游離態(tài)酚類的水相中加入10 mL 4 mol/L NaOH溶液，同時充入氮氣，室溫條件下?lián)u床振蕩反應4 h后，用6 mol/L HCl溶液調pH 2，該部分酚類物質萃取過程同上。

糖苷鍵合態(tài)酚類的制備：向上述提取完酯鍵合態(tài)酚類的水相中再加入4 mL HCl溶液，85 ℃水解反應30 min，該部分酚類物質萃取過程同上。

1.3.1.2 酚酸含量的測定

酚酸含量測定采用福林-酚法[20-21]，以沒食子酸為標準品，選用96 孔板進行測定。取25 μL樣品或標準品溶液和125 μL 0.2 mol/L福林-酚試劑于室溫反應10 min后，加125 μL 10 g/100 mL飽和Na2CO3溶液，在振蕩器上緩慢搖勻后室溫條件下放置反應30 min，在765 nm波長處測定吸光度。由沒食子酸系列標準溶液制作標準曲線，以干質量計算樣品酚酸含量，結果表示為mg/g。

1.3.1.3 黃酮含量的測定

黃酮的測定采用亞硝酸鈉-三氯化鋁法[20-21]，以兒茶素為標準品，選用96 孔板進行測定。取25 μL樣品或標準品溶液與110 μL 0.066 mol/L NaNO2溶液室溫混合反應5 min后，加入15 μL的0.75 mol/L AlCl3溶液反應6 min，最后加入100 μL 0.5 mol/L NaOH溶液，在振蕩器上緩慢搖勻室溫反應10 min后在510 nm波長測定吸光度。由兒茶素系列標準質量濃度制作標準曲線，以干質量計算樣品黃酮含量，結果表示為mg/g。

1.3.1.4 亞鐵離子還原能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）測定

FRAP測定采用文獻[20-21]測定方法進行，具體測定步驟如下：

實驗試劑的配制：40 mmol/L鹽酸溶液：取12 mol/L濃鹽酸 0.1 mL加水至30 mL；20 mmol/L三氯化鐵溶液：稱取0.270 3 g的FeCl3·6H2O，用超純水定容至50 mL；0.3 mol/L醋酸鈉緩沖溶液：稱取三水醋酸鈉0.31 g，加冰醋酸1.6 mL，然后再用超純水稀釋定容至100 mL；10 mmol/L TPTZ溶液：稱取TPTZ樣品31.233 mg，用40 mmol/L鹽酸定容至10 mL，置于4 ℃冰箱中保存；FRAP工作液：醋酸鈉緩沖溶液，三氯化鐵溶液和TPTZ溶液按10∶1∶1的體積進行混合，制得質量濃度為0.04 mg/mL的工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

測定方法：加10 μL樣品或FeSO4標品溶液和180 μL預熱至37 ℃的FRAP工作液至96 孔板，在振蕩器上避光搖勻37 ℃反應10 min，于593 nm波長處測定其吸光度。以FeSO4系列標準溶液制作標準曲線，樣品抗氧化活性以達到同樣吸光度所需的FeSO4物質的量（mmol/g）表示。

1.3.1.5 DPPH自由基清除能力測定

DPPH自由基清除能力測定采用文獻[20-21]方法進行，具體測定步驟如下：

加100 μL 0.065 mmol/L DPPH-甲醇溶液與100 μL樣品或空白溶液于96 孔板中，避光條件下在振蕩器上緩慢搖勻后室溫條件下反應30 min，使用酶標儀在517 nm波長測定其吸光度。建立Trolox含量與DPPH自由基清除率的標準曲線，樣品DPPH自由基清除能力以達到同樣消除率所需的Trolox質量（mg/g）計，DPPH自由基清除率計算見式（1）：

式中：Ai為樣品溶液加DPPH試劑混合液的吸光度；Aj為樣品溶液加80%甲醇的吸光度；Ac為DPPH溶液加樣品溶劑的吸光度。

1.3.1.6 ABTS陽離子自由基清除能力測定

ABTS陽離子自由基清除能力測定根據(jù)文獻[20,22]的方法進行，具體測定步驟如下：

實驗試劑的配制：將5 mL 7.0 mmol/L ABTS儲備液與88 μL 140 mmol/L K2S2O8混勻，靜置12～16 h，配制成ABTS工作液。ABTS工作液用80%甲醇溶液稀釋，使混合溶液在734 nm波長處吸光度為0.7±0.02。

測定方法：200 μL ABTS溶液和20 μL樣品或標品溶液分別加入96 孔板中，避光條件下在振蕩器上緩慢搖勻室溫反應6 min，在734 nm波長測定吸光度，建立Trolox含量與自由基清除率的標準曲線，樣品ABTS陽離子自由基清除能力以達到同樣消除率所需Trolox質量（mg/g）表示，ABTS陽離子自由基清除率計算見公式（2）：

式中：A0為ABTS溶液和樣品溶劑混合液的吸光度；Ai為ABTS溶液和樣品溶液混合液的吸光度；Aj為80%甲醇溶液和樣品溶液的吸光度。

1.3.2 UPLC-Q TOF-MS定性分析

定性分析參考Peng Han等[23]條件，并適當調整，具體實驗條件如下：

UPLC條件：色譜分離采用UPLC系統(tǒng)（Agilent 1290 infinity series），包含脫氣機、二元泵（Bin Pump SL）、進樣器（HiP-ALS）、柱溫箱（TCC SL）、二極管陣列檢測器。使用Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。流動相：含0.1%甲酸溶液（A）和甲醇溶液（B），梯度洗脫程序：0～10 min，5%～10% B；10～30 min，10%～30% B；30～38 min，30%～50% B；38～43 min，50% B；43～45 min，50%～5% B。進樣量5 μL，柱溫35 ℃，流速0.3 mL/min，檢測波長280 nm。

MS條件：采用飛行時間質譜儀（Agilent 6538 Q TOF），電子電離源，采用全掃描負離子模式掃描。全質譜數(shù)據(jù)在m/z 50～1 000質量范圍下獲得，最佳質譜參數(shù)：毛細管電壓3.5 kV；霧化氣壓力30 psi；干燥氣流速10.0 L/min；干燥氣溫度300 ℃；裂解電壓175 V；母離子MS2碰撞能10～40 V。

1.3.3 HPLC-QQQ-MS定量分析

定量分析參考Peng Han等[23]條件進行，并適當調整，具體實驗條件如下：

HPLC條件：色譜分離采用HPLC系統(tǒng)（Agilent 1260 infinity series），包含脫氣機、二元泵（Bin Pump SL）、進樣器（HiP-ALS）、柱溫箱（TCC SL）、二極管陣列檢測器。使用Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）。流動相：0.1%甲酸溶液（A）和甲醇溶液（B），梯度洗脫程序：0～18 min，5%～50% B；18～25 min，50%～95% B；25～28 min，95%～5% B。進樣量5 μL，柱溫35 ℃，流速0.3 mL/min。

MS條件：采用三重四極桿質譜儀（Agilent 6430 QQQ），電子電離源，采用質譜多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）負離子模式用于定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 酚酸、黃酮含量及抗氧化能力分析

由表1可知，80%甲醇溶液提取物中酚酸含量為3.44 mg/g，黃酮含量為2.50 mg/g。80%甲醇溶液提取物中以不同鍵存在的酚酸、黃酮含量不同，其中糖苷鍵合態(tài)酚酸含量最高，可達1.44 mg/g，游離酚類物質黃酮含量最高，可達0.85 mg/g，而以酯鍵合態(tài)形式存在的酚類物質酚酸、黃酮含量最低，分別為1.06 mg/g和0.17 mg/g。李思荻等[24]測定出紅小豆提取物中酚酸含量為1.403 9～2.754 8 mg/g，低于本實驗研究結果；而Gan Renyou等[25]研究表明，總酚、總黃酮含量分別為13.37 mg/g和9.41 mg/g；Sreerama等[26]所測赤豆提取物中總酚、黃酮含量分別為4.89～8.78 mg/g和5.06～5.81 mg/g，均高于本實驗結果，這可能是由實驗所用原料品種、區(qū)域、提取方法及測定方法差異導致。

表 1 赤豆提取物的酚類含量及其抗氧化能力測定Table 1 Total phenolic content and antioxidant activity of adzuki bean extract

如表1所示，80%甲醇溶液提取物中FRAP、DPPH自由基清除能力、ABTS陽離子自由基清除能力分別為42.04 mmol/g、5.46 mg/g、14.92 mg/g。80%甲醇溶液提取物中不同存在形式酚類提取物的抗氧化能力不同，其中FRAP為糖苷鍵合態(tài)＞游離態(tài)＞酯鍵合態(tài)；酯鍵合態(tài)提取物DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力均為最強，而糖苷鍵合態(tài)最弱，酯鍵合態(tài)酚類物質DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力分別為1.54、3.50 mg/g，糖苷鍵合態(tài)酚類物質DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力分別為0.79、1.21 mg/g。Gan Renyou等[25]研究表明，赤豆提取物FRAP、ABTS陽離子自由基清除能力分別為139 mmol/g、95.3 mmol/g，高于本研究結果；Sreerama等[26]所測赤豆提取物FRAP、DPPH自由基清除能力分別為27.39～34.36 mmol/100 g、4.44～5.70 μmol/g，低于本研究結果，可能是由于原料栽培品種及提取物中所含的酚類物質種類及含量不同。

2.2 UPLC-Q TOF-MS定性分析

采用UPLC-Q TOF-MS對80%甲醇溶液提取物中酚類物質進行鑒定，根據(jù)化合物的保留時間、紫外吸收光譜、質譜測定的分子離子峰和碎片離子峰數(shù)據(jù)、標準品的保留時間等信息，結合參考文獻和數(shù)據(jù)庫（Metlin）對其結構進行初步鑒定。其總離子流色譜如圖1所示、280 nm波長色譜如圖2所示。鑒定結果見表2，初步鑒定出25 種化合物，包括3 種有機酸、6 種酚酸和16 種黃酮。王海棠等[1]通過化學檢識、紙色譜、薄層色譜和紫外、紅外、核磁共振、質譜等技術鑒定出赤豆提取物中含有蘆丁；Amarowicz等[35]從赤豆粗提物中鑒定出原兒茶酸、對香豆素、槲皮素、兒茶素、表兒茶素衍生物、楊梅素糖苷、山奈酚糖苷、原花青素等物質；Takahama等[36]從赤豆提取物中鑒定出兒茶素、表兒茶素、花旗松素、蘆丁、槲皮素；Bai Yan等[37]從赤豆提取物中鑒定出異槲皮素、蘆丁、綠原酸、異木犀草素己糖苷。本實驗在赤豆80%甲醇溶液提取物中新鑒定出對羥基苯甲酸、茵芋苷、金絲桃苷、黃豆苷元、黃豆黃素、芹菜素衍生物6 種酚類物質。

圖 1 80%甲醇溶液提取物負離子模式下總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatogram of 80% methanol extract in negative ion mode

圖 2 80%甲醇溶液提取物負離子模式下280 nm波長色譜圖Fig. 2 DAD chromatogram at 280 nm of 80% methanol extract in negative ion mode

表 2 赤豆80%甲醇溶液提取物中酚類化合物鑒定Table 2 Characterization of phenolic compositions of 80%methanol extract

續(xù)表2

2.3 HPLC-QQQ-MS定量分析

表 3 酚類化合物負離子模式下的定量條件及其在80%甲醇溶液提取物中的含量Table 3 Quantitative analysis conditions for phenolics in negative ion mode and their contents in 80% methanol extract

對所鑒定成分中11 種酚類物質進行定量分析，由表3可以看到，赤豆80%甲醇溶液提取物中蘆丁、兒茶素類物質含量最高，分別為327.40 μg/g和210.70 μg/g，其次為原兒茶酸、對香豆酸，黃豆苷元、槲皮素、金絲桃苷、綠原酸，而對羥基苯甲酸、木犀草素、黃豆黃素含量最低，分別為0.52、0.16 μg/g和0.09 μg/g。Amarowicz等[35]對赤豆提取物進行定量分析，測得原兒茶酸、對香豆素、槲皮素、兒茶素、楊梅素糖苷、山奈酚糖苷含量分別為67.6、31.3、36.2、688.0、212.0 μg/g和38.2 μg/g；Gan Renyou等[25]對赤豆皮提取物進行定量分析得到赤豆皮蘆丁含量為（0.42±0.02）mg/g；Bai Yan等[37]對赤豆提取物進行定量分析，測得異槲皮素、蘆丁、綠原酸、異木犀草素己糖苷含量分別為0.8、4.1、14.0 mg/g和1.3 mg/g。上述研究實驗結果高于本研究結果，可能是因為原料品種提取方法及定量分析方法等存在差異。

3 結 論

赤豆作為一種藥食同源的豆科植物，所含的豐富營養(yǎng)素和植物化學物成分受到許多研究者的關注。本實驗對80%甲醇溶液提取的上清液及其中以不同鍵合態(tài)存在的酚類物質進行分離提取，結果表明，糖苷鍵合態(tài)酚類物質酚酸含量最高，可達1.44 mg/g，游離酚類物質黃酮含量最高，可達0.85 mg/g，而以酯鍵合態(tài)形式存在的酚類物質酚酸、黃酮含量最低，分別為1.06 mg/g和0.17 mg/g；比較3 種存在形式酚類提取物抗氧化能力，糖苷鍵合態(tài)提取物FRAP最強，可達15.76 mmol/g，而DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力最弱，分別為0.79、1.21 mg/g，酯鍵合態(tài)提取物DPPH自由基、ABTS陽離子自由基清除能力最強，分別為1.54、3.50 mg/g，而FRAP最弱，為9.19 mmol/g。本實驗采用UPLC-Q TOF-MS對赤豆80%甲醇溶液提取物進行定性分析，共鑒定出3 種有機酸、6 種酚酸、16 種黃酮；并使用HPLC-QQQ-MS對其中11 種酚類物質進行定量分析，結果表明赤豆中含有豐富的兒茶素和蘆丁類化合物，本研究可為赤豆的進一步高值化開發(fā)利用提供科學數(shù)據(jù)。