王瓊芬，鄭平安，劉 婷，張夢奇

（1.舟山市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，浙江 舟山 316021；2.海力生集團(tuán)有限公司，浙江 舟山 316021）

鱈魚肝油是從高緯度的挪威等國的深海鱈魚肝臟中提取的油脂，鱈魚不雜食、干凈、無污染，提取的魚肝油品質(zhì)優(yōu)良安全，深受全球消費(fèi)者青睞。鱈魚肝油富含天然VA、VD3以及多種陸地上沒有的歐米伽-3（omega-3）不飽和脂肪酸，其中二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）含量很高，是人體自身不能合成但又不可缺少的重要營養(yǎng)素[1-3]。尤其是DHA，是人體神經(jīng)系統(tǒng)生長及維持的主要元素，是大腦和視網(wǎng)膜的重要構(gòu)成成分，對嬰幼兒的智力和視力發(fā)育至關(guān)重要，具有保護(hù)視網(wǎng)膜、改善視力、促進(jìn)嬰幼兒智力發(fā)育、提高記憶力等作用[4-9]。目前全球藥用級和保健級的鱈魚肝油品牌多達(dá)百種，需求量很大，占整個(gè)魚肝油市場的95%以上。純鱈魚肝油天然資源短缺，價(jià)格昂貴，不法廠商為牟利，在鱈魚肝油中摻兌一定比例的廉價(jià)魚油以降低成本，嚴(yán)重?fù)p害消費(fèi)者的利益。監(jiān)管上僅僅依賴測定標(biāo)志性成分VA、VD3、DHA與EPA含量是不夠的，不法廠商可以通過添加合成VA和VD3、乙酯型DHA使摻假鱈魚肝油中各項(xiàng)標(biāo)志性成分符合指標(biāo)要求，但實(shí)則為摻假的鱈魚肝油，真假難以鑒定。本實(shí)驗(yàn)通過一種柱前衍生氣相色譜技術(shù)，對鱈魚肝油及魚油樣品中的脂肪酸進(jìn)行相對含量測定，經(jīng)多樣本分析比較，找出具有特征指標(biāo)的脂肪酸，建立特征脂肪酸二維摻假模型，繪制不同摻假程度的識別分析圖，運(yùn)用該分析圖可實(shí)現(xiàn)對鱈魚肝油摻假魚油的快速鑒定，有效規(guī)范魚肝油市場存在的摻假亂象。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同品牌鱈魚肝油樣品46 批（包括原料、口服液體和軟膠囊），原料由海力生集團(tuán)有限公司提供，口服液體和軟膠囊均來自市售和網(wǎng)購；魚油軟膠囊樣品30 批，均來自市售和網(wǎng)購；甲醇、異辛烷（均為色譜純）美國J.T.Baker公司；氫氧化鈉、硫酸、無水硫酸鈉（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度均大于99%） 美國NU-CHEK公司和美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A氣相色譜儀（配有氫火焰離子化檢測器）美國Agilent公司；CPA 225D分析天平 德國Sartorius公司；DTK-200干式恒溫器 杭州米歐儀器有限公司；MS 3圓周振蕩器 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

鱈魚肝油中所含脂肪酸是以甘油酯形式存在[10]，沸點(diǎn)高，不能直接提取后氣相色譜測定，需進(jìn)行柱前衍生處理[11-14]，即將鱈魚肝油先皂化后甲酯化，轉(zhuǎn)化為低沸點(diǎn)的脂肪酸甲酯，再經(jīng)有機(jī)溶劑提取后進(jìn)樣測定。

準(zhǔn)確稱取鱈魚肝油樣品100 mg放置于20 mL帶螺口反應(yīng)瓶中，加1.5 mL 2%氫氧化鈉-甲醇溶液，旋緊瓶蓋，旋渦混合30 s，放置于90 ℃恒溫器中加熱20 min，冷卻。加2 mL 5 g/100 mL硫酸-甲醇溶液，旋緊瓶蓋，旋渦混合30 s，放置于100 ℃恒溫器中加熱10 min，冷卻。準(zhǔn)確加入2 mL異辛烷，旋緊瓶蓋，旋渦混合1 min，立即加5 mL飽和氯化鈉溶液，輕搖，靜置分層。吸取上清液轉(zhuǎn)移至裝有少量無水硫酸鈉的具塞試管中，振搖脫水，即得。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

準(zhǔn)確稱取棕櫚酸甲酯、棕櫚油酸甲酯、油酸甲酯、EPA甲酯、DHA甲酯標(biāo)準(zhǔn)品適量放置于20 mL棕色容量瓶中，加異辛烷溶解并定容，制成含棕櫚酸甲酯4.97 mg/mL、棕櫚油酸甲酯2.94 mg/mL、油酸甲酯6.21 mg/mL、EPA甲酯3.84 mg/mL、DHA甲酯6.05 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent DB-23石英毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：起始溫度170 ℃，以1 ℃/min速率升溫至225 ℃并保持5 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；檢測器溫度280 ℃；載氣（N2）流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比150∶1。

1.3.4 面積歸一化法計(jì)算脂肪酸相對含量

樣品中各脂肪酸占總脂肪酸的相對含量（Yi）按下式計(jì)算（相對峰面積小于0.2%不計(jì)）：

式中：Ai為各脂肪酸峰面積；Fi為各脂肪酸轉(zhuǎn)換系數(shù)。

1.3.5 鱈魚肝油中摻假魚油模型的設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)鱈魚肝油中分別摻入質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度為5%、15%、25%、50%魚油的摻假樣品模型，以摻假樣品中的鯨蠟烯酸相對含量為橫坐標(biāo)，DHA/EPA值為縱坐標(biāo)，繪制摻假識別分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

鱈魚肝油樣品中含有二十多種脂肪酸，本研究對15 種典型脂肪酸采用甲酯對照品進(jìn)行定位確認(rèn)，各脂肪酸出峰排列順序見圖1。15 種典型脂肪酸中包含3 對同分異構(gòu)體，分別是油酸（順-9-十八碳烯酸）/異油酸（順-11-十八碳烯酸）、順-9-二十碳烯酸/順-11-二十碳烯酸、鯨蠟烯酸（順-11-二十二碳烯酸）/芥酸（順-13-二十二碳烯酸），這3 對同分異構(gòu)體結(jié)構(gòu)相近，在色譜中的分離難度很大，想要獲得滿意的分離度，必須對色譜條件進(jìn)行優(yōu)化[15]。氣相色譜中影響化合物分離的最重要因素是色譜柱和柱溫，脂肪酸甲酯測定通常采用極性色譜柱，同類型色譜柱不同固定相、牌號和規(guī)格對脂肪酸的分離性能有較大的差異[16]。實(shí)驗(yàn)中采用規(guī)格為（30 m×0.25 mm，0.25 μm），不同固定相及牌號（DB-23、DB-WAX、Rtx-WAX）的毛細(xì)管柱，結(jié)果顯示DB-23色譜柱對脂肪酸分離效果最佳，油酸/異油酸異構(gòu)體能達(dá)到基線分離，但另兩對異構(gòu)體的分離效果不佳，分離度小于1.3。改變程序升溫條件和流速也無法達(dá)到基線分離，故考慮增加色譜柱的長度，采用規(guī)格為（60 m×0.25 mm，0.25 μm）的DB-23毛細(xì)管柱，兩對異構(gòu)體的分離效果明顯改善，分離度均達(dá)到1.3以上。通過對不同升溫程序?qū)Ψ蛛x度影響考察，最終確定最佳升溫程序?yàn)槠鹗紲囟葹?70 ℃，以1 ℃/min的速率升溫至225 ℃并保持5 min。實(shí)驗(yàn)中對進(jìn)樣口溫度、檢測器溫度、載氣流速、分流比均進(jìn)行考察，結(jié)果顯示上述幾個(gè)因素對脂肪酸分離效果的影響不明顯。

圖 1 鱈魚肝油特征色譜圖Fig. 1 GC chromatogram of fatty acids in cod liver oil

2.2 柱前衍生化條件的選擇

甲酯化率是影響脂肪酸測定準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素，目前常用的甲酯化方法有堿催化法、酸催化法和三氟化硼催化法[17-20]，現(xiàn)行版食品脂肪酸測定標(biāo)準(zhǔn)和歐美藥典收載的魚肝油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均采用三氟化硼甲醇溶液作催化劑[21-23]。本研究分別考察上述3 種方法的催化效率，結(jié)果顯示鱈魚肝油甲酯化中堿催化效率僅為酸催化的50%，酸催化法中鹽酸催化效率低于硫酸催化，三氟化硼催化效率與硫酸基本一致?？紤]到三氟化硼甲醇溶液毒性大、易燃易爆，對實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境存在較大的安全隱患，且價(jià)格昂貴。本研究采用硫酸催化法替代國內(nèi)外魚肝油和魚油脂肪酸測定中最常用的三氟化硼催化法，并對皂化時(shí)間、皂化溫度、甲酯化時(shí)間、甲酯化溫度4 個(gè)因素采用L16（45）正交試驗(yàn)，以EPA、DHA含量為考察指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)選，結(jié)果顯示當(dāng)皂化溫度90 ℃、皂化時(shí)間20 min、甲酯化溫度100 ℃、甲酯化時(shí)間10 min時(shí)，測得樣品中脂肪酸含量最高，方法穩(wěn)定性最好，該法檢測成本低，并符合綠色化學(xué)的要求。

2.3 柱前衍生化方法準(zhǔn)確性考察結(jié)果

為考察柱前衍生化方法的準(zhǔn)確性，選擇鱈魚肝油中5 種代表性脂肪酸，其中棕櫚酸代表飽和脂肪酸、棕櫚油酸和油酸代表單不飽和脂肪酸、EPA和DHA代表多不飽和脂肪酸，對5 種脂肪酸進(jìn)行含量測定重復(fù)性和加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。

2.3.1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

準(zhǔn)確稱取同一批號的鱈魚肝油樣品6 份，每份100 mg，按1.3.1節(jié)方法制備樣品溶液，按1.3.3節(jié)色譜條件操作，混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液依次進(jìn)樣測定，外標(biāo)法計(jì)算樣品中5 種脂肪酸含量，由表1可見，5 種脂肪酸的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.0%，表明該柱前衍生化方法重復(fù)性良好。

表 1 脂肪酸含量及加標(biāo)回收率Table 1 Contents and recoveries of fatty acids from spiked sample

2.3.2 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

準(zhǔn)確稱取2.3.1節(jié)已測知含量的樣品50 mg，共9 份，分別置于20 mL帶螺口反應(yīng)瓶中，準(zhǔn)確加入混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.8、1.0、1.2 mL各3 份，制成加標(biāo)水平為80%、100%、120%的加標(biāo)樣品，按1.3.1節(jié)制備樣品溶液，按1.3.3節(jié)色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算樣品中5 種脂肪酸加標(biāo)回收率，結(jié)果見表1，5 種脂肪酸的平均加標(biāo)回收率在98.22%～99.54%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為均小于2.0%，表明該柱前衍生化方法準(zhǔn)確可靠。

2.4 鱈魚肝油和魚油脂肪酸特征分析

鱈魚肝油是從鱈魚肝臟提取的脂肪油，魚油是從魚類脂肪提取的脂肪油。通過對全部樣品中各脂肪酸相對總脂肪酸相對含量的測定和分析，顯示兩者的脂肪酸種類和數(shù)量基本相同，但含量區(qū)別明顯，與文獻(xiàn)[24]報(bào)道的基本一致。鱈魚肝油中各脂肪酸含量因鱈魚產(chǎn)地和油脂提取工藝的不同有所差異，測得的脂肪酸相對含量在一個(gè)相對較窄的波動(dòng)區(qū)間（限度范圍）內(nèi)。魚油則受魚種、產(chǎn)地、季節(jié)、加工部位以及提取工藝等因素的影響，含量波動(dòng)區(qū)間大于鱈魚肝油[25-27]。鱈魚肝油和魚油樣品中測得的典型脂肪酸含量范圍見表2，鱈魚肝油所含脂肪酸相比魚油呈現(xiàn)兩大特征：1）鱈魚肝油中DHA含量明顯高于EPA含量，46 批鱈魚肝油樣品中除2 批疑似摻假樣品外，DHA、EPA相對含量比（DHA/EPA）均在1.40～1.68范圍內(nèi)，均值為1.55，而魚油樣品中的DHA含量明顯低于EPA含量，DHA/EPA為0.64～0.75，均值為0.69。2）鱈魚肝油中順-11-二十碳烯酸和鯨蠟烯酸相對含量明顯高于魚油，兩種脂肪酸在鱈魚肝油和魚油中的平均比值高達(dá)5.0和5.2。當(dāng)鱈魚肝油中摻入一定量的魚油將導(dǎo)致DHA/EPA、順-11-二十碳烯酸和鯨蠟烯酸相對含量下降，尤其是鯨蠟烯酸，在其他魚肝油中（鯊魚肝油、金槍魚肝油）幾乎沒有，在魚油中含量很低，僅在鱈魚肝油中有較高含量，具有很強(qiáng)的特征性，因此從DHA/EPA和鯨蠟烯酸相對含量的變化規(guī)律可以對鱈魚肝油中摻假魚油進(jìn)行判別。

表 2 鱈魚肝油和魚油脂肪酸相對含量限度Table 2 Fatty acid contents of pure cod liver oil and fish oil

2.5 脂肪酸特征指標(biāo)變化規(guī)律及摻假判別

2.5.1 摻假識別分析圖的建立

查閱有關(guān)文獻(xiàn)，目前對魚油中摻假植物油的分析鑒定方法有過報(bào)道[28-30]，但魚肝油中摻假魚油的研究鮮見報(bào)道，本研究根據(jù)鱈魚肝油脂肪酸的特征指標(biāo)及其變化規(guī)律，建立一種比較直觀的摻假模型，根據(jù)各樣品脂肪酸相對含量測定結(jié)果，對樣品進(jìn)行分析篩選，選定其中28 批魚肝油樣品、17 批魚油樣品（脂肪酸測定結(jié)果基本一致的不同批次樣品，僅選其中一批次）的摻假數(shù)據(jù)用于模型輸入，以鯨蠟烯酸相對含量為橫坐標(biāo)，DHA/EPA值為縱坐標(biāo)，建立摻兌5%、15%、25%和50%魚油的摻假模型，繪制摻假識別分析圖，見圖2。當(dāng)鱈魚肝油中摻兌不同比例的魚油時(shí)，不同摻假水平呈現(xiàn)一定的分布規(guī)律，脂肪酸分布具有較為明顯的區(qū)域性。

圖 2 摻假鱈魚肝油脂肪酸識別分析Fig. 2 Discriminant analysis diagram of fatty acid methyl esters from adulterated cod liver oil

2.5.2 摻假樣品的判別

待鑒定樣品按1.3.1節(jié)的方法制備樣品溶液，按1.3.3節(jié)色譜條件測定各脂肪酸峰面積并計(jì)算相對含量，當(dāng)鯨蠟烯酸相對含量和（或）DHA/EPA值超過限度范圍時(shí)（DHA/EPA為1.40～1.68），可判定該鱈魚肝油樣品中摻假魚油，再從識別分析圖中找到相應(yīng)的坐標(biāo)位置，即可對摻假程度作出直觀判別。

2.5.3 摻假案例分析

對46 批鱈魚肝油樣品進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)有2批樣品中DHA/EPA值和鯨蠟烯酸相對含量均偏離限度，一批DHA/EPA為1.16，鯨蠟烯酸相對含量為6.74%，另一批DHA/EPA為1.13，鯨蠟烯酸相對含量為5.32%，在摻假模型中畫出該2 批樣品所在坐標(biāo)點(diǎn)（圖中圓點(diǎn)位置），見圖2，圓點(diǎn)的位置落在25%的摻假區(qū)域內(nèi)，由此可判定該2批鱈魚肝油中摻兌了約25%的魚油。

3 結(jié) 論

鱈魚肝油含多種功效成分，尤其是omega-3不飽和脂肪酸具有多種生理活性作用，目前在保健品市場占有較大的份額。由于優(yōu)質(zhì)純鱈魚肝油采用深海銀鱈魚肝臟提取而得，產(chǎn)量有限，資源緊缺，其價(jià)格遠(yuǎn)高于普通魚油，故鱈魚肝油中摻兌魚油存在較大的牟利空間。再者現(xiàn)有保健級鱈魚肝油產(chǎn)品質(zhì)量控制主要基于對指標(biāo)成分的定量分析，此質(zhì)控手段存在較大的片面性，對為達(dá)指標(biāo)而人為添加合成VA、VD3和乙酯型DHA的摻假行為不能進(jìn)行有效識別，導(dǎo)致鱈魚肝油摻假現(xiàn)象屢見不鮮。為科學(xué)有效打擊摻假行為，本研究建立一種簡便、準(zhǔn)確、環(huán)保的脂肪酸測定方法，對鱈魚肝油和魚油中的各脂肪酸相對含量進(jìn)行快速測定。通過對不同來源、不同產(chǎn)地、不同品牌的多樣本脂肪酸含量進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，確定鱈魚肝油和魚油中13 種典型脂肪酸的相對含量限度范圍，并找出兩者中具有鑒定意義的特征性脂肪酸（DHA、EPA和鯨蠟烯酸）及其變化規(guī)律，建立以DHA/EPA值和鯨蠟烯酸相對含量為特征指標(biāo)的摻假判別方法，該法可快速對鱈魚肝油中摻假魚油的行為進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，為科學(xué)打假提供一種可靠、直觀、簡便的手段，有效規(guī)范魚肝油市場。