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        乳酸菌飲料中嗜酸乳桿菌的實時熒光定量PCR檢測方法

        2019-05-21 11:58:50張娜娜竇同海段文鋒翁史昱
        食品科學(xué) 2019年8期
        關(guān)鍵詞:酸乳乳酸菌核酸

        張娜娜,劉 洋,*,俞 漪,趙 渝,竇同海,徐 瓊,段文鋒,翁史昱

        (1.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院,國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(上海),上海 200233;2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234;3.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200438;4.上海市質(zhì)量管理科學(xué)研究院(上海),上海 200050)

        嗜酸乳桿菌是重要的益生菌,被大量應(yīng)用在食品中[1]。研究表明嗜酸乳桿菌能在乳制品中產(chǎn)生乳酸,并能通過氨基酸代謝增加風(fēng)味[2-3]。嗜酸乳桿菌主要作用有降低pH值、產(chǎn)生抗菌素(如嗜酸菌素和乳酸殺菌素等),在一定程度上抑制腸道中有害微生物的有害作用[4-6]。有研究[7-9]發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌對大腸桿菌、腹瀉致病菌等均有抑制作用;大量的嗜酸乳桿菌還可阻礙膽固醇的合成,降低血漿中膽固醇含量[10];另外對于乳糖不耐癥也有一定的療效[11-12]。嗜酸乳桿菌對腸道菌群的平衡和對微生態(tài)的調(diào)節(jié)也證明其對健康具有促進的作用[13-14]。在我國,飲料中添加益生菌特別是嗜酸乳桿菌成為新的發(fā)展趨勢[15-16]。

        關(guān)于益生菌的使用我國發(fā)布了一系列的法律法規(guī),2016年,衛(wèi)計委關(guān)于印發(fā)《可用于食用的菌種名單》的通知(衛(wèi)辦監(jiān)督發(fā)[2010]65號)[17],規(guī)定食品中允許使用的菌種。2013年衛(wèi)生部發(fā)布關(guān)于食品中使用菌種標(biāo)簽標(biāo)識有關(guān)問題的復(fù)函(衛(wèi)辦監(jiān)督函[2013]367號)[18]中明確指出,預(yù)包裝食品中使用了上述菌種的,應(yīng)當(dāng)按照GB 7718—2011《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則》[19]的要求標(biāo)注其菌種名稱,企業(yè)可同時在預(yù)包裝食品上標(biāo)注相應(yīng)的菌株名、菌株號和活菌量。2016年制定了關(guān)于乳酸菌檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.35—2016《食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》并在GB 7101—2015《飲料》規(guī)定乳酸菌飲料產(chǎn)品標(biāo)簽應(yīng)標(biāo)明活菌或非活菌,標(biāo)識活菌的其活菌數(shù)至少要達到1×106CFU/mL[20-21]。標(biāo)準(zhǔn)檢測方法操作復(fù)雜、結(jié)果判讀時間長,很難滿足市場快速檢測的要求。為防止市場上出現(xiàn)濫竽充數(shù)的情況,建立基于分子水平的菌種特異性鑒定方法十分重要[22]。

        目前在DNA水平上的分子檢測方法越來越多,其檢測方法快速方便、靈敏、省時被廣泛應(yīng)用到物種檢測中[23]。其中實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)因其高特異性、高靈敏度、無污染等優(yōu)點,在食品檢測中備受青睞。本研究建立基于嗜酸乳桿菌SPIDR保守區(qū)域的序列結(jié)合實時熒光定量PCR方法定量檢測飲料中的嗜酸乳桿菌,以保障食品安全監(jiān)管順利進行。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        據(jù)2016年衛(wèi)計委發(fā)布,衛(wèi)辦監(jiān)督發(fā)《可用于食品的菌種名單》[7]與市場上常見的乳酸菌菌株及可能存在的致病菌,本研究所選菌株為嗜酸乳桿菌4 株,非嗜酸乳桿菌共17 株,其中包括乳桿菌14 株,嗜熱鏈球菌、大腸桿菌以及沙門氏菌各1 株。菌株樣本見表1。菌種購買后均由上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院自行保存。

        表 1 標(biāo)準(zhǔn)菌種名稱及其編號Table 1 Information about standard strains used in this study

        1.2 儀器與設(shè)備

        5430R振蕩水浴槽 德國艾本德有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱 美國Shellab公司;ESCO LA2-4A1生物安全柜 新加坡藝思高公司;7500 Fast熒光定量PCR儀美國ABI公司。

        1.3 方法

        1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株及乳酸菌飲料中嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)

        按照GB 4789.35—2016方法進行培養(yǎng)[21]。

        1.3.2 乳酸菌核酸提取

        改良的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)法提取核酸[24]。

        標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸提?。河脽o菌棉簽沾取培養(yǎng)基上的菌株,在裝有無菌水的2 mL離心管中洗脫,離心,加入400 μL溶菌酶(50 ng/μL),37 ℃孵育2 h,再加入40 μL蛋白酶K(20 mg/mL)和400 μL SDS,56 ℃水浴2 h,后按照核酸提取的步驟提取核酸。

        乳酸菌飲料及模擬樣品中核酸提?。簶悠坊靹?,取2 mL加入離心管中,2 000×g離心5 min,上清液移至新的離心管中,加入5 mL無菌水,混勻,沸水中放置10 min,2 000×g離心5 min,上清液移至新的離心管中,再次9 000×g離心10 min,去上清液,沉淀加入400 μL溶菌酶(50 ng/μL),37 ℃孵育2 h,再加入40 μL蛋白酶K(20 mg/mL)和400 μL SDS,56 ℃水浴2 h,后按照核酸提取的步驟提取核酸。

        1.3.3 引物、探針設(shè)計

        在NCBI網(wǎng)站上(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)下載嗜酸乳桿菌NCFM基因組,利用SPIDR的保守區(qū)域序列,借助ClustalW 軟件對此序列進行比對,然后使用Primer Express 3 軟件設(shè)計引物、探針(NCFM F:5’-GTGATCTTTCCTTCACTGCGT-3’;NCFM R:5’-TCCTCGATGGTAACTCTGTAGC-3’;NCFM P:5’-FAM-TGTGCTTCAGGGTTACCTCCACTTTCABQH-3’)用于嗜酸乳桿菌的鑒定,擴增片段為213 bp,在NCBI網(wǎng)站上使用BLAST數(shù)據(jù)庫比對引物和探針的理論特異性。乳桿菌通用引物序列(ST16s F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;ST 1495 R:5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’)用于擴增提取的DNA,檢驗提取物中含有核酸,作為對照。引物和探針均由英濰捷基生物公司合成。

        1.3.4 PCR條件及檢測

        普通PCR采用20 μL體系進行PCR擴增,其中包括10 μL TaKaRa Ex Taq mix,上、下游引物(5 μmol/L)各1 μL,探針(5 μmol/L)0.5 μL,2 μL DNA模板,去離子水補足至20 μL。

        普通PCR條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,退火溫度依次為56、58、60、62、64、60 s,72 ℃退火40 s,38 個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

        PCR產(chǎn)物檢測方法:取 5 μL PCR產(chǎn)物,在 1.0%瓊脂糖凝膠和0.5% TE緩沖液中電泳28 min(120 V),然后采用凝膠成像系統(tǒng)拍照存檔。

        1.3.5 實時熒光定量PCR

        實時熒光定量PCR體系為20 μL,包含TaKaRa Prober Taq mix 10 μL,上、下游引物(5 μmol/L)各1 μL,探針(5 μmol/L)0.5 μL,2.0 μL DNA 模板,去離子水補足至20 μL。采用實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行擴增。反應(yīng)參數(shù):95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s,60 ℃退火35 s,40 個循環(huán)。

        1.3.6 檢測方法的特異性、靈敏度和重復(fù)性測試

        特異性測試:采用4 株嗜酸乳桿菌菌株,14 株近緣乳桿菌,以及3 株其他細菌的核酸為模板,采用建立的實時熒光定量PCR體系進行檢測。

        靈敏度測試:包括相對靈敏度和絕對靈敏度的檢測。絕對靈敏度測試選取4 株嗜酸乳桿菌,分別將提取的核酸溶液進行稀釋,核酸質(zhì)量濃度依次為58、5.8、0.58、0.058、0.005 8、0.000 58、0.000 058 ng/μL,進行熒光擴增。相對靈敏度測試將嗜酸乳桿菌ATCC4356培養(yǎng)液進行稀釋提取的核酸為模板,采用建立的實時熒光定量PCR體系進行檢測。靈敏度的檢測每個質(zhì)量濃度設(shè)置6 個平行,實驗重復(fù)3 次,最終滿足不小于96%置信區(qū)間的要求。

        重復(fù)性測試:采用嗜酸乳桿菌ATCC4356標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸的6 個質(zhì)量濃度的梯度稀釋液進行擴增,每個質(zhì)量濃度4 個平行,計算Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation,SD)和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。

        1.3.7 實時熒光定量PCR體系的抗干擾能力檢測

        對建立的實時熒光定量PCR體系抗干擾能力測試包括培養(yǎng)物水平抗干擾能力檢測和核酸水平抗干擾能力檢測。核酸水平是將提取的嗜酸乳桿菌ATCC4356核酸稀釋至58、5.8、0.58、0.058、0.0058、0.000 58 ng/μL,分別添加300 pg/μL、3 ng/μL、30 ng/μL的大腸桿菌ATCC25922核酸,對制備的混合核酸模板進行實時熒光定量PCR擴增;培養(yǎng)物水平是將嗜酸乳桿菌ATCC4356培養(yǎng)至108CFU/mL后依次稀釋至10 CFU/mL,然后添加濃度為104CFU/mL和106CFU/mL的大腸桿菌ATCC25922,并提取核酸。每個濃度2 個平行,每個樣品重復(fù)3 次。

        1.3.8 模擬樣品檢測

        利用建立好的實時熒光定量PCR技術(shù)對模擬樣品進行檢測,模擬樣品的制作:嗜酸乳桿菌ATCC4356培養(yǎng)至109CFU/mL,以市場上購買不含嗜酸乳桿菌的乳酸菌飲料作為基質(zhì),進行梯度稀釋,最終將稀釋液進行核酸提取,以該核酸為模板擴增。每個濃度進行5 個平行。

        1.3.9 實際樣品檢測

        市場上隨機購買樣品共11 份,其中5 份樣品的標(biāo)簽標(biāo)記不含嗜酸乳桿菌,6 份樣品標(biāo)記含有嗜酸乳桿菌,按建立的實時熒光定量PCR方法對樣品進行檢測。每個樣品3 個平行。

        1.4 數(shù)據(jù)與圖像處理

        實驗使用的儀器自帶軟件7500 Fast System Software v1.3.2在擴增過程中自動進行分析并得出Ct值,統(tǒng)計學(xué)分析則借助SPSS 14.0進行。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 普通PCR的溫度優(yōu)化

        利用普通PCR進行溫度優(yōu)化,擴增溫度分別選擇56、58、60、62、64 ℃幾個梯度,結(jié)果如圖1所示,擴增效率最高的是60 ℃,后續(xù)實驗選擇60 ℃為體系的擴增溫度。

        圖 1 普通PCR擴增溫度優(yōu)化Fig. 1 Optimization of amplification temperature through traditional PCR

        2.2 實時熒光定量PCR方法的特異性

        圖 2 實時熒光定量PCR特異性Fig. 2 Specificity of real-time fluorescence quantitative PCR

        如圖2A所示,所有嗜酸乳桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株均有明顯擴增,且Ct值在16~18之間,其他菌株均無明顯的擴增;如圖2B所示,采用乳桿菌通用引物對所有菌株進行擴增時,可見到清晰的擴增條目。證明本研究建立的實時熒光定量PCR檢測方法對于嗜酸乳桿菌有較好的特異性。

        2.3 檢測方法的靈敏度

        2.3.1 實時熒光定量PCR方法的絕對靈敏度

        表 2 實時熒光定量PCR檢測的絕對靈敏度Table 2 Aabsolute sensitivity of real-time fluorescence quantitative PCR

        如表2所示,嗜酸乳桿菌ATCC4356、CICC6082、NCFM、La-14可穩(wěn)定檢測的最低質(zhì)量濃度為0.000 58 ng/μL。每個模板添加4 μL,即檢測限在3 pg左右,本研究的實時熒光定量PCR體系的絕對靈敏度達到3 pg。

        2.3.2 實時熒光定量PCR的相對靈敏度

        表 3 實時熒光定量PCR的相對靈敏度Table 3 Relative sensitivity of real-time fluorescence quantitative PCR

        相對靈敏度檢測是將嗜酸乳桿菌ATCC4356的培養(yǎng)液按照10 倍梯度稀釋法從108~102CFU/mL各濃度取1 mL提取核酸,然后進行實時熒光定量PCR擴增。由表3可以看出,嗜酸乳桿菌ATCC4356的絕對靈敏度可穩(wěn)定檢出的最低濃度為103CFU/mL。根據(jù)絕對靈敏度和相對靈敏度的檢測可得出實時熒光定量PCR的檢測限為103CFU/mL。

        2.4 實時熒光定量PCR方法的重復(fù)性檢測結(jié)果

        表 4 實時熒光定量PCR的重復(fù)性檢測Table 4 Rrepeatability of real-time quantitative PCR

        如表4所示,嗜酸乳桿菌ATCC4356不同的核酸濃度擴增,每個質(zhì)量濃度6 個平行,最終實驗結(jié)果Ct值的SD介于0.14~0.56之間,RSD介于0.862%~2.55%之間,均在可接受范圍內(nèi)。證明建立的實時熒光定量PCR方法重復(fù)性較好。

        2.5 實時熒光定量PCR方法的抗干擾能力

        表 5 實時熒光定量PCR在培養(yǎng)物水平上的抗干擾能力Table 5 Anti-interference ability of real-time fluorescence quantitative PCR against E. coli culture

        表 6 實時熒光定量PCR純基因水平上的抗干擾能力(Ct值)Table 6 Anti-interference ability of real-time fluorescence quantitative PCR against E. coli genome

        在實際檢測中,樣品中的菌株一般是目標(biāo)菌和其他菌株的混合物,因此在培養(yǎng)物水平進行檢測可以排除樣品中或在提取過程中混入雜菌的可能性;在純基因水平進行抗干擾能力的檢測可以排除在擴增過程中出現(xiàn)交叉污染的情況。由表5可以看出,在樣品中混入103、106CFU/mL的雜菌對實時熒光定量PCR的擴增是沒有干擾的,且檢出限仍為103CFU/mL;由表6可以看出,在不同濃度的嗜酸乳桿菌ATCC4356的核酸中添加300 pg/μL、3 ng/μL、30 ng/μL的大腸桿菌ATCC25922的核酸提取物,各濃度梯度核酸檢出的Ct值均未受影響,證明建立的實時熒光定量PCR擴增體系抗干擾能力強。

        2.6 模擬樣品的檢測及標(biāo)準(zhǔn)曲線

        為驗證建立的方法是否可以在實際樣品中進行檢測,在進行實樣檢測之前,利用模擬樣品對該方法進行驗證。這樣不僅可以節(jié)約時間,且節(jié)省成本在不含嗜酸乳桿菌的乳酸菌飲料為基質(zhì)的模擬樣品檢測中,以Ct值為縱坐標(biāo),以嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)株已知的不同稀釋菌數(shù)對數(shù)值(lg(CFU/g))為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出線性方程為y=-3.312 4x+38.939,R2=0.987,檢測結(jié)果的線性較好且檢測限仍為103CFU/mL。說明本實驗建立的實時熒光定量PCR的檢測方法可行,且檢測的結(jié)果與實際添加量是一致的。

        2.7 實際樣品檢測結(jié)果

        對市售的11 份樣品采用建立的實時熒光定量PCR方法進行檢測,利用乳桿菌通用引物進行擴增,樣品核酸全部擴增出目的條帶,表明樣品中已提出可擴增的DNA;采用嗜酸乳桿菌屬的特異性引物、探針擴增,含有嗜酸乳桿菌的6 份乳酸菌飲料全部擴增出目標(biāo)條帶,定量檢測結(jié)果表7所示。

        表 7 實際樣品的實時熒光定量PCR檢測結(jié)果Table 7 Detection of actual samples by real-time fluorescence quantitative PCR

        由表7可以看出,11 份樣品中,6 份樣品檢測出含有嗜酸乳桿菌,編號分別為B1、B4、B6、B7、B8、B9,這與購買樣品的便簽信息一致。檢測結(jié)果可以看出,嗜酸乳桿菌的含量在5.83×102~3.68×104CFU/mL之間,建立的實時熒光定量PCR方法可以用砸乳酸菌飲料中對嗜酸乳桿菌進行定量。

        3 討論與結(jié)論

        乳酸菌飲料中添加嗜酸乳桿菌的產(chǎn)品越來越多,且價格較高,利益驅(qū)使下可能會出現(xiàn)“濫竽充數(shù)”的現(xiàn)象,值得監(jiān)管部門重視。我國衛(wèi)生部曾發(fā)布相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定:乳酸菌飲料中益生菌活菌的添加量要不低于106CFU/mL。目前對于乳酸菌飲料特別是非活菌飲料中益生菌的菌種鑒定、益生菌定量檢測缺少快速、準(zhǔn)確、特異性、高通量的檢測方法。

        傳統(tǒng)方法一般依賴于國家標(biāo)準(zhǔn)對嗜酸乳桿菌進行檢測,即基于培養(yǎng)法,耗時耗力,結(jié)果受操作者經(jīng)驗影響較大,難以滿足市場精確鑒定和定量的要求。利用分子生物法進行檢測的手段已在食品微生物檢測中得到應(yīng)用[25-28]。Guo Zihao[29]和包秋華[30]等研究了發(fā)酵食品中嗜酸乳桿菌的檢測技術(shù),有研究表明利用熒光定量PCR方法對發(fā)酵乳中的乳酸菌或雙歧桿菌進行檢測,并與平板計數(shù)法進行比較,結(jié)果顯示PCR法與平板法技術(shù)結(jié)果相符[31-33]。這些均證明實時熒光定量PCR可以在乳酸菌飲料的檢測中應(yīng)用,且具有快速、通量高、重復(fù)性高等優(yōu)點。目前,國內(nèi)外對嗜酸乳桿菌的定性定量檢測研究報道較少。本實驗建立乳酸菌飲料中添加嗜酸乳桿菌的定性定量檢測方法,對方法的特異性、靈敏度、重復(fù)性、抗干擾能力等多方面參數(shù)進行研究,結(jié)果表明該方法具有很強的實用性。

        本研究利用設(shè)計的嗜酸乳桿菌屬的特異性引物建立實時熒光定量PCR方法在乳酸菌飲料中的檢測應(yīng)用。結(jié)果證明,該方法的特異性好,檢測限低,純基因水平檢測限在3 pg左右,絕對靈敏度檢測達到103CFU/mL,且重復(fù)性較好;在純基因水平與培養(yǎng)物水平的抗干擾能力都很強;模擬樣品檢測中其檢測限未改變,重復(fù)性較好,證明適合在市場檢測中使用;實際樣品檢測結(jié)果與標(biāo)簽信息一致。并得出嗜酸乳桿菌相應(yīng)的添加量,只是嗜酸乳桿菌的含量有所不同。這一研究證明該方法可應(yīng)用在乳酸菌飲料中嗜酸乳桿菌的快速檢測。

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